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原代培养腹侧中脑神经元上的大麻素Ⅱ型受体在MPP+诱导的神经元损伤中的作用研究认领

作者：

刘曼

学位授予单位：

青岛大学

摘要：

帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一种以黑质致密部多巴胺（dopamine,DA）能神经元丢失和细胞内存在路易小体为特征的神经退行性疾病。PD患者出现震颤、肌强直等运动障碍以及痴呆、焦虑、嗜睡、泌尿系统症状、注意力缺陷和低血糖等非运动症状。PD的病因不明,神经炎症、氧化应激、线粒体功能障碍均参与PD的发病。越来越多的研究表明,黑质（substantia nigra,SN）区异常积聚的铁可与H2O2反应产生自由基,导致DA能神经元的丢失。SN区的铁含量与PD的严重程度呈正相关。目前,治疗PD的常用药物左旋多巴（levodopa,L-DOPA）虽然在PD早期很有效,但长期服用引起的并发症会极大限制L-DOPA的临床应用。因此,寻找更有效的DA能神经元死亡的神经保护剂,对于PD治疗,降低易患个体的风险具有深远的意义。内源性大麻素系统（endogenous cannabinoid system,ECS）在PD的发病机制中起着重要作用。ECS的主要受体:大麻素Ⅰ型受体（cannabinoid type 1 receptor,CB1R）和大麻素受体Ⅱ型受体（cannabinoid type 2 receptor,CB2R）。研究表明,PD的发病过程中有CB2R的参与,大麻素相关化合物激活CB2R可以在包括PD在内的神经退行性疾病中维持神经元的稳态和存活。在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的PD小鼠模型中,蛋白质印迹和免疫荧光结果显示腹侧中脑（ventral mesencephalon,VM）CB2R蛋白水平升高。选择性CB2R激动剂JWH133和AM1241抑制了MPTP诱导的DA能神经元和轴突终末的变性。AM1241还可以有效地逆转由MPTP诱导的CB1R敲除小鼠的运动缺陷,增加DA的释放,并改善DA能神经元的存活状态。此外,选择性CB2R激动剂GW842166x对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）诱导的小鼠DA能神经元丧失及其相关的运动功能缺陷具有保护作用。近期研究发现,神经元上也有CB2R表达,但SN区DA能神经元上的CB2R的生物学作用以及是否直接参与PD的发病还不清楚。本实验应用1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）诱导原代培养的VM神经元制备PD细胞模型,探讨激活神经元上的CB2R是否能直接对DA能神经元发挥保护作用。使用CB2R激动剂JWH133、CB2R拮抗剂AM630预处理VM神经元30 min后,加入MPP+共处理24 h,运用流式细胞术检测VM神经元线粒体膜电位（mitochondrial transmembrane potential,ΔΨm）变化和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;通过免疫印迹（western blot）技术检测各组VM神经元酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH）、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）、环氧化酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）、二价金属离子转运蛋白1（divalent metal transporter 1,DMT1）和铁转出蛋白1（ferroportin1,FPN1）蛋白的变化。实验结果如下:1.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元TH蛋白表达下降（P<0.01）;1μM JWH133预处理后,显著抑制由MPP+造成的TH蛋白表达的减少（P<0.01）;1μM AM630可拮抗JWH133预处理对VM神经元TH的作用（P<0.01）。2.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元ΔΨm明显降低（P<0.001）;1μM JWH133预处理后,明显改善MPP+诱导的神经元ΔΨm的下降（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.05）。3.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元ROS水平明显升高（P<0.001）;1μM JWH133预处理后,明显抑制MPP+引起的ROS水平升高（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.001）。4.与对照组相比,MPP+（100μM）处理组VM神经元Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显下降（P<0.001）;1μM JWH133预处理组的Bcl-2/Bax比值较MPP+组相比有所升高（P<0.001）;AM630与JWH133共同处理组与JWH133预处理组相比,Bcl-2/Bax比值下降（P<0.01）。5.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元cleaved caspase-3蛋白表达升高（P<0.01）;JWH133（1μM）预处理可抑制由MPP+造成的cleaved caspase-3蛋白表达的增加（P<0.01）;1μM AM630处理可拮抗JWH133预处理对VM神经元cleaved caspase-3的作用（P<0.01）。6.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元i NOS蛋白表达升高（P<0.01）;1μM JWH133预处理后,明显抑制由MPP+造成的i NOS蛋白升高（P<0.05）;加入1μM AM630可拮抗JWH133的作用（P<0.05）。7.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元COX-2蛋白表达明显升高（P<0.05）;该作用可以被JWH133（1μM）预处理所阻断（P<0.05）;加入AM630（1μM）后,JWH133抑制MPP+造成VM神经元COX-2表达增加的作用消失（P<0.01）。8.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元DMT1蛋白表达升高（P<0.01）;1μM JWH133预处理阻断由MPP+造成的DMT1的升高（P<0.05）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以逆转JWH133的作用（P<0.05）。9.与对照组相比,100μM MPP+处理组VM神经元FPN1蛋白表达下降（P<0.05）;1μM JWH133预处理后,可以明显改善由MPP+造成的FPN1蛋白的下降（P<0.01）;JWH133和AM630（1μM）共处理可以对抗JWH133的作用（P<0.05）。以上结果提示,使用JWH133激活CB2R对MPP+诱导的DA能神经元损伤具有保护作用。JWH133通过激活CB2R不仅抑制MPP+引起的VM神经元ROS的增加、线粒体膜电位的下降、Bcl-2/Bax蛋白表达的下降以及cleaved caspase-3蛋白的增加,还能抑制MPP+引起VM神经元DMT1表达上调、FPN1表达下调以及COX-2和i NOS表达上调。这表明JWH133激活CB2R所发挥的保护作用可能与减轻氧化应激、减少铁聚集、抗凋亡以及抗炎作用相关。我们的研究为进一步了解CB2R发挥保护作用提供了新的实验依据。

摘要译文

关键词：

大麻素Ⅱ型受体; JWH133; 原代培养神经元; 帕金森病

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

生理学

导师：

马泽刚

中图分类号：

R742.5[震颤麻痹综合征⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27262/d.cnki.gqdau.2022.002414