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Tax蛋白通过YAP抑制ATL细胞天然免疫应答认领

作者：

苟洪伟

学位授予单位：

浙江师范大学

摘要：

人类T细胞白血病病毒1型（Human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1）是第一个被发现与人类疾病相关的逆转录RNA病毒,它是导致成人T细胞白血病（Adult T-cell leukemia,ATL）的唯一致病因素。HTLV-1前病毒基因组约为9 kb,其p X区编码了一系列调节蛋白,如p12、p13、p30、p21、Rex、Tax和HBZ等,它们在HTLV-1持续潜伏感染及致癌过程中发挥着重要作用。其中病毒蛋白Tax通过异常调控一些肿瘤相关的信号通路,如NF-κB、AP-1和SRF等,从而促进病毒感染细胞的克隆性增殖,促进病毒复制,引发恶性转化,最终导致ATL的发生。I型干扰素（I-IFN）是机体抗病毒天然免疫反应的关键效应因子。HTLV-1感染后,其编码的Tax蛋白通过多种策略抑制天然免疫的应答,进而帮助HTLV-1逃逸宿主天然免疫系统的检查。但在大多数ATL细胞中,Tax由于具有较高的免疫原性被宿主免疫系统识别后而被快速清除,因而几乎很难检测到Tax的表达。但HTLV-1可在人体内持续潜伏感染数十年之久而不引发免疫反应。因此,HTLV-1可能通过细胞内的其它因子维持了对天然免疫的持续抑制。近年来,Hippo信号通路下游的效应蛋白YAP被研究证明是一个致癌基因。在肿瘤发生过程中,肿瘤细胞通过不同的机制活化YAP,活化后的YAP通过调控肿瘤细胞内的多条信号通路从而影响肿瘤发生的进展。近来的研究表明YAP是机体抗病毒天然免疫反应的负调控因子。据此,我们猜测:HTLV-1感染后是否通过YAP调控天然免疫应答,进而影响了ATL的最终发生呢?为了解答这一猜想,本课题主要探究了Tax通过YAP影响ATL细胞天然免疫应答的分子机制及其具体的生理意义。主要进行了以下几部分的研究: 第一部分:YAP蛋白在HTLV-1阳性细胞株中高表达 Hippo通路YAP蛋白是一个公认的癌蛋白,它的异常表达与许多肿瘤的发生有关。首先,探究了YAP在ATL细胞株中的表达情况,分别选取了两种HTLV-1阴性细胞株（Molt-4,Jurkat）以及六种HTLV-1阳性细胞株（ATL-T,ATL-2,MT-1,MT-2,MT-4,TL-Om1）,随后采用Western bolt以及q RT-PCR检测各个细胞中YAP的表达情况。结果表明,相较于HTLV-1阴性细胞,在HTLV-1阳性细胞株中,YAP在蛋白以及基因水平的表达都有升高。随后检测了YAP下游相关靶基因的表达。研究发现YAP下游与细胞增殖相关的两个靶基因CTGF和CYR61在HTLV-1阳性细胞中均有不同程度的高表达。以上研究结果表明,HTLV-1的感染可促进YAP的表达,并且能激活YAP的调控功能。第二部分:YAP负调控ATL细胞的天然免疫信号转导天然免疫是机体抵御外来病原体入侵最为重要的一道防线。研究指出Hippo信号通路的多个核心成分都参与调控了宿主的天然免疫反应,而且最近的研究发现YAP负调控了宿主的抗病毒天然免疫反应。因此,首先利用报告基因实验探究了YAP对ATL细胞中天然免疫应答的影响。结果显示,YAP能显著抑制TBK1,IKKε,RIG-I,STING+CGAS,IRF3诱导激活的天然免疫相关报告基因IFN-β-Luc,ISRE-Luc的荧光素酶活性。同时通过q RT-PCR实验发现,YAP抑制了IFNs诱导的天然免疫信号通路下游ISGs（干扰素刺激基因）的表达,如IFN-β,IFNT1/2。随后在HTLV-1未感染的T细胞中观察到YAP能显著抑制poly I:C激活的天然免疫信号。接下来采用基因过表达/沉默的方式检测了YAP对ATL细胞中天然免疫信号激活的影响。结果显示,当YAP的表达在ATL中升高时天然免疫信号的激活及ISGs的表达均受到抑制。而当沉默YAP后,ATL中受到抑制的天然免疫信号及ISGs的表达均有不同程度的恢复。随后在采用YAP抑制剂VP处理ATL细胞后,天然免疫信号的激活以及ISGs的表达均有升高。综上,被HTLV-1活化后的YAP负调控ATL细胞中的天然免疫应答。第三部分:Tax通过激活YAP调控天然免疫应答为了探究HTLV-1感染的阳性细胞中YAP活化的原因。首先通过转染HTLV-1全病毒质粒（p X1MT-M）检测了YAP的表达。研究发现HTLV-1能够促进YAP蛋白的表达。随后通过Western blot检测了HTLV-1编码的关键蛋白Tax和HBZ对YAP表达的影响,结果表明在经Cd Cl2诱导Tax表达的JPX-9细胞中,YAP的表达有明显的升高,而在稳定表达HBZ的Jurkat-HBZ细胞中YAP的表达没有显著的变化。这表明HTLV-1感染后主要是由Tax蛋白引起了YAP蛋白表达的升高。在第一章的研究中发现HTLV-1的感染能够激活YAP的功能,随后利用含有YAP下游效应元件的报告基因质粒（8XGTII-Luc）探究了Tax对YAP功能的影响。研究发现Tax能在YAP的基础上进一步增强YAP对8XGTII-Luc的激活。免疫共沉淀实验发现Tax能与YAP发生结合,且主要靶向了YAP的1-174aa片段。这些结果表明Tax不仅能促进YAP的表达而且能够激活YAP的功能。研究报道HTLV-1编码的Tax蛋白能抑制了天然免疫反应。随后利用报告基因实验验证了Tax对天然免疫的影响。与之前研究结果一致,通过报告基因实验发现Tax显著抑制了IFN-β信号的激活。接下来采用CRISPR/cas-9技术构建了沉默YAP的稳定ATL细胞系。通过报告基因实验发现,在沉默YAP后被Tax抑制的IFN-β信号得到了部分恢复,而在补加YAP后,恢复的IFN-β信号重新被抑制。随后,在使用YAP抑制剂VP处理ATL细胞后观察到,天然免疫信号以及下游ISGs的表达均得到了部分恢复。进一步的机制研究发现,Tax能增强YAP与IKKε的结合,且Tax在YAP的基础上进一步抑制了TBK1与IRF3的结合,进而阻碍了IRF3的活化,最终抑制了天然免疫应答。据此,以上结果表明,Tax可以通过调控YAP进而抑制天然免疫应答。第四部分:YAP通过抑制天然免疫促进VSV病毒复制为了进一步探究YAP对抗病毒天然免疫反应的影响。在沉默或过表达YAP的细胞株中采用流式细胞术检测YAP对VSV-e GFP病毒复制的影响。实验结果显示当YAP表达量升高时,VSV的复制增强,当YAP表达量降低时,VSV的复制受到抑制。以上结果表明YAP通过抑制细胞内天然免疫,从而帮助病毒在宿主体内的持续复制。综上所述,本研究发现HTLV-1编码的病毒蛋白Tax通过活化YAP进而实现了对天然免疫的抑制作用,以促进病毒的复制,进而导致最终ATL的发生。在机制上,Tax通过直接靶向YAP的1-174 aa片段从而激活YAP的功能;且Tax增强了YAP与IKKε的结合,同时在YAP的基础上进一步阻碍了TBK1对IRF3的活化,最终减弱天然免疫上下游信号通路的激活。另一方面,持续活化的YAP维持了HTLV-1病毒对ATL细胞中天然免疫的持续抑制,有助于HTLV-1在宿主体内的持续感染。本研究一方面阐明了Tax通过YAP调控天然免疫的分子机制,同时揭示了ATL细胞中YAP活化及功能激活的诱因,及其在Tax缺失后在天然免疫中的重要调控作用。该研究成果为阐明HTLV-1病毒致癌分子机制提供线索,并为ATL的临床治疗提供新的策略和靶点。

摘要译文

关键词：

成人T细胞白血病; 人类T细胞白血病病毒1型; 天然免疫; Tax蛋白; YAP蛋白

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

赵铁军

中图分类号：

R392[医学免疫学]

学科分类号：

100102[医学免疫学];100601[中西医结合基础医学]

D O I：

10.27464/d.cnki.gzsfu.2022.000855