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血管紧张素转化酶与其抑制肽Leu-Lys-Pro（LKP）作用机理的研究认领

被引量： 4

作者：

徐晓晴

学位授予单位：

广西大学

摘要：

天然蛋白来源提取出的活性肽可影响多种生理过程,其中具有抑制血管紧张素转化酶（Angiotensin-ⅠConverting Enzyme,ACE）活性的肽被称为血管紧张素转化酶抑制肽,ACE抑制肽具有安全、温和、无副作用的优点,可起到高血压辅助治疗作用。研究ACE抑制肽与ACE结合的作用机理对于开发应用ACE抑制肽具有重要意义。本文选取由鲣鱼蛋白中提取出的三肽LKP作为研究对象,探索在HEPES、ACES缓冲液体系中LKP对ACE抑制作用的机理,主要包括以下研究内容:以新鲜猪肺为原料,经过匀浆、硫酸铵分级盐析和透析等多步纯化,获得ACE粗酶液,采用DEAE-FF阴离子交换层析-超滤法对粗酶液进一步纯化,最终获得截留液。经过一系列的分离纯化后获得电泳级纯度的ACE,比活达到1.87 U/mg,总的酶活回收率为35.9%,纯化倍数为311.7。确定LKP的抑制类型、IC50值。通过Lineweaver-Buck双倒数作图法,确定LKP的抑制类型为混合型抑制类型。测定抑制肽LKP的IC50值为0.318μmol/L。研究LKP对ACE抑制作用的热动力学,采用等温滴定量热法（Isothermal titration calorimetry,ITC）测得LKP与ACE结合的焓变（ΔH）、熵变（ΔS）、化学计量比（n）以及结合常数（Ka）等热力学参数,判断结合反应的非共价键结合力。实验结果表明LKP与ACE的结合反应是自发进行的放热反应,在HEPES及ACES缓冲液中的结合驱动力都是以熵驱动为主,非共价键结合力主要为疏水作用。LKP主要是通过和ACE氨基酸残基间形成的疏水作用力,改变ACE的空间构象从而抑制ACE的活性。采用紫外吸收光谱法、荧光光谱法以及圆二色谱法进一步研究LKP对ACE空间构象的影响。实验结果表明,LKP可以结合ACE形成新的稳定的复合物,猝灭ACE的内源荧光,猝灭机制为静态猝灭,LKP与ACE结合达到饱和后,再继续加入LKP,ACE的空间结构依然会发生改变,说明游离的LKP虽然不再和ACE结合,但仍然可以影响ACE的空间构象。圆二色谱结果显示,LKP能够导致ACE的二级结构发生改变,蛋白质结构会先变松散后折叠紧密,HEPES缓冲液中ACE最终结构比未加入LKP时要松弛,ACES缓冲液中,ACE最终结构比无LKP时更加紧密。利用分子对接技术研究LKP与ACE的结合模型。结果显示,在HEPES体系中,结合最佳构象是LKP在ACE活性中心结合,ACES体系中最佳结合构象是LKP与ACE表面非活性部位结合,LKP与ACE氨基酸残基都是通过疏水作用以及氢键结合。

摘要译文

关键词：

血管紧张素转化酶; 纯化; ACE抑制肽; 光谱法; 抑制机理

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

化学工程与技术

导师：

廖丹葵

中图分类号：

TQ460.1[基础理论]

学科分类号：

081702[化学工艺];1007[药学]

D O I：

10.27034/d.cnki.ggxiu.2021.001562