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光敏电荷反转纳米粒递送聚肌胞苷酸用于三阴性乳腺癌治疗的研究认领

作者：

方磊

学位授予单位：

上海大学

摘要：

三阴性乳腺癌（TNBC）是具有雌激素、孕激素、HER2受体表达阴性（ER-、PR-、HER2-）表型的一类乳腺癌,具有高度的侵袭性,易复发,易转移,严重危害女性的健康。TNBC占所有乳腺癌病例的～15%,其死亡率占所有乳腺癌相关死亡病例的25%。目前,化疗仍然是临床上三阴性乳腺癌治疗的主要方法,但其易导致肿瘤耐药、转移且毒副作用大,使患者的临床获益显著下降。因此,迫切需要开发安全高效的治疗方法以提高TNBC治疗的疗效。免疫治疗是继手术治疗,放疗,化疗后又一重要的临床肿瘤治疗手段,旨在增强机体免疫应答以消除恶性肿瘤细胞,在晚期TNBC治疗中取得了明显进展。2019年,化疗药物（Abraxane,白蛋白紫杉醇）与免疫治疗药物（Tecentriq）联用治疗无法进行手术切除、PD-L1阳性的局部晚期或转移性TNBC的临床治疗方案得到FDA的加速批准,有望显著提高TNBC治疗的疗效。常用于免疫治疗的核酸类药物,例如聚肌胞苷酸(Poly（I:C）),Cp G-寡脱氧核苷酸（Cp G ODN）,信使RNA（m RNA）疫苗以及作用于免疫相关通路的小干扰RNA（si RNA）在抗肿瘤免疫治疗中被广泛应用,以提高肿瘤细胞免疫原性。但核酸类药物容易被肾小球过滤或被血浆中的核酸酶快速分解,导致了其在目标部位蓄积差;同时因其具有负电性、分子量大等物理化学性质,不易被肿瘤细胞摄取。非病毒基因递送系统具有免疫原性低、生产成本低、重现性好及安全性高等优点,广泛应用于递送核酸类药物。阳离子纳米载体作为非病毒基因递送系统的一种,能通过静电相互作用荷载核酸类药物,提高其稳定性,改善其体内分布及在靶细胞的摄取。但是,纳米载药系统经细胞摄取后,其具有的正电性仍会阻碍核酸药物的胞内释放,从而导致药物失活、降解和疗效下降。针对肿瘤特异性环境,如弱酸环境、酶环境及乏氧环境,并利用近红外光、温度、磁场等外部刺激,设计刺激响应性纳米载体来促进核酸药物的释放,有望提高核酸药物用于肿瘤免疫治疗的疗效,从而实现对三阴性乳腺癌的有效治疗。本文首先利用对巯基苯硼酸的巯基与多肽Fmoc-KCRGDK结构中半胱氨酸的巯基反应构建FK-PBA;利用聚乙烯亚胺（PEI）的氨基与Ce6的羧基酰胺缩合构建PEI-Ce6;利用硼酸与聚乙烯醇（PVA）的间二醇结构形成六元环硼酸酯将PVA修饰至FK-PBA,并与PEI-Ce6通过纳米共沉淀自组装形成光控电荷反转纳米粒LCCN。PEI的氨基质子化后使纳米粒具有正电性,以荷载Poly（I:C）形成LCCN-Poly（I:C）纳米复合物。该纳米载药系统具有活性氧（ROS）及还原环境双重刺激响应性:六元环硼酸酯具有ROS敏感性,负载的Ce6在近红外照射下产生大量的ROS诱导其发生化学键断裂。断键产生的酚氧负离子,可屏蔽PEI氨基,使纳米粒的表面电位由正电反转为负电,促进Poly（I:C）的释放;而FK-PBA的二硫键在还原环境中发生断裂,使得纳米粒进一步被破坏。我们首先对LCCN进行了处方筛选并考察了其理化特性,结果表明当FK-PBA/PVA质量比为15:1,PVA分子量为67 k Da时,能自组装形成～113.4 nm的均一球形纳米粒,其中Ce6的载药量为17.6±0.3%。在近红外光照射后,LCCN水化粒径减小～20 nm且表面电荷发生反转;进一步与1 m M谷胱甘肽（GSH）孵育后,纳米粒被完全破坏。我们进一步考察了LCCN对Poly（I:C）的荷载能力及光控释药特性,结果表明LCCN能有效荷载Poly（I:C）;琼脂糖凝胶电泳结果显示,近红外光照射能有效促进Poly（I:C）释放。同时,我们探究了LCCN的细胞摄取、光毒性及体外诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡（ICD）的能力。4T1细胞对LCCN的摄取呈时间依赖性。LCCN具有显著的光毒性,4T1细胞给与0.5μg/m L Ce6+200 m W/cm2近红外光照射后,其相对存活率下降87%。LCCN介导的光动力效应显著诱导ICD,钙网蛋白（CRT）的细胞膜外翻增加,高迁移率族蛋白（HMGB1）核外排增多及细胞外泌三磷酸腺苷（ATP）增多。在4T1荷瘤小鼠中分布实验结果表明,LCCN有效提高了核酸类药物在肿瘤部位的蓄积。我们进而考察了LCCN-Poly（I:C）对肿瘤相关淋巴结树突状细胞（DC）及肿瘤免疫微环境的影响。纳米复合物能促进DC熟化,激活抗肿瘤免疫应答,同时促进细胞毒T淋巴细胞（CTLs）的肿瘤浸润,下调调节性T细胞（Fox P3+CD4+T）的比例。4T1荷瘤小鼠抗肿瘤药效评价结果显示,基于LCCN-Poly（I:C）的光动力-免疫联合治疗有效抑制了4T1原位瘤和远端移植瘤的生长,延长了小鼠的生存期。研究结果表明:我们构建的光控电荷反转纳米粒LCCN能有效提高Poly（I:C）的肿瘤递送并实现光控释药,同时LCCN-Poly（I:C）介导的光动力-免疫联合治疗显著增强了机体抗肿瘤免疫应答,提高对TNBC原位瘤与远端移植瘤的治疗效果,具有一定的临床转化潜力。

摘要译文

关键词：

纳米粒; 三阴性乳腺癌; 光动力治疗; 免疫治疗; 聚肌胞苷酸

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

有机化学

导师：

李亚平

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨];TQ460.1[基础理论]

学科分类号：

1002[临床医学];081702[化学工艺];1007[药学]

D O I：

10.27300/d.cnki.gshau.2020.000555