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乌饭色素的酶促合成及其机制研究认领

作者：

祁子严

学位授予单位：

苏州大学

摘要：

乌饭树(Vaccinium bracteatum Thunb.)鲜叶作为天然染色剂,在自唐代以来沿袭至今的传统习俗中用于制做“乌米”饭食用,效果优良。现代研究已经证明,该染色过程是一种复杂的酶促反应,乌饭树叶中的环烯醚萜苷、大米蛋白是主要反应底物。但迄今为止,乌饭色素形成的具体分子反应机制尚未阐明,限制了乌饭树叶的扩大应用。本研究在前期工作基础上,对乌饭叶染米涉及的酶促反应机制进行验证,并首次以重要色素前体——乌饭树苷为原料,氨基酸为反应物,模拟研究外源性的多酚氧化酶(PPO)、β-葡萄糖苷酶分别单独催化合成乌饭色素(VBP)的反应机制,考察VBP的酶促仿生合成工艺和抗氧化活性,为乌饭色素的产业化应用提供科学依据。采用乌饭叶染米实验,选用酪氨酸酶(E1;PPO)、β-葡萄糖苷酶(E2)两种外源酶,考察和验证两种酶在参与乌饭叶染米过程的重要作用。结果证明PPO、β-葡萄糖苷酶均可独立参与乌饭叶染米反应,是酶促染米的关键因素。采用色差仪和梯度定量分析实验,初步证实复合酶组(E1+E2)在中低剂量范围使用时与E2组等效,在10～15×高剂量范围使用时显著强于E1、E2单独使用组,提示高剂量时两种酶可能有协同增强作用。本研究对PPO参与乌饭黑色素的形成给出了直接实验证据。选用酪氨酸酶、β-葡萄糖苷酶两种外源性酶,考察乌饭树苷与20种氨基酸酶促合成乌饭蓝的反应规律和机制。结果表明,乌饭树苷是一种独特的双官能团分子,酪氨酸酶、β-葡萄糖苷酶可分别与该分子中的对-羟基桂皮酸、水晶兰苷基团发生反应,并进而与氨基酸聚合反应生成乌饭蓝VBP-P、VBP-B。结合UV-vis、HPLC、HPSEC分析,证明两种酶催化反应机制和产物不同,但产物颜色、以及与氨基酸反应的选择性具有相似性,具体如下: (1)两种酶均可与氨基酸的伯胺基发生反应。其中,脂肪族中性氨基酸产物色价较高,β-CH3取代有利于增强VBP-P产物色价,但不利于VBP-B。芳香族氨基酸Phe、Tyr、His的产物色价中等、弱于脂肪族中性氨基酸,疏水性的Phe色价均较高。 (2)碱性氨基酸Arg、Lys、His的产物色价中等;酸性氨基酸Glu、Asp的产物色价较弱。这可能与两种酶活性的适宜pH范围(4～6)有关。 (3)有5个氨基酸均不能反应生成乌饭蓝。Ser、Thr含有亲核-OH,可能优先与两种酶促反应的醌式中间体结构反应,从而抑制或干扰了伯氨基的聚合反应。Pro、Trp结构中仅有仲胺基,不能进行反应。还原剂Cys可抑制该两种酶的酶促反应进行。选用两步法,分别对E1、E2催化合成乌饭蓝色素的过程参数进行优化。当固定乌饭树苷用量为1.6 mg时,第一步反应中选用酪氨酸酶的用量145.6 U(RR 1.84%),优化反应条件为pH 5.0 PBS溶液、50℃反应2 h;选用β-葡萄糖苷酶的用量324.9 U(RR 2.86%),优化反应条件为pH 5.0PBS溶液、60℃反应3h。第二步甘氨酸聚合反应中,酪氨酸酶、β-葡萄糖苷酶反应液分别加入60、48 mg甘氨酸反应时产物的色价最高,两种酶的反应条件均为温度80℃、反应时间3 h。制备的乌饭蓝-P色素经纯化后,测定其色价为90.5。采用体外抗氧化活性分析,测定乌饭蓝-P对清除ABTS、DPPH的IC50值分别为0.0092、0.0141 mg/mL,均显著强于芦丁对照品。综上所述,本文确证了 PPO、β-葡萄糖苷酶在VBP形成中的关键作用。首次以双功能基团化合物乌饭树苷为反应底物,对乌饭蓝的酶促合成机制进行深入研究,对乌饭蓝色素的制备方法和工艺进行考察优化和抗氧化活性检测,为研发乌饭色素新产品、推进实现其创新应用提供了科学依据。

摘要译文

关键词：

乌饭树; 乌饭树苷; 氨基酸; 乌饭色素; 多酚氧化酶; β-葡萄糖苷酶

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

生药学

导师：

刘江云

中图分类号：

TS264.4[食用色素]

学科分类号：

082202[发酵工程];083202[农产品加工及贮藏工程]

D O I：

10.27351/d.cnki.gszhu.2022.003843