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右旋糖酐-DHA-多西他赛偶联物的制备及其抗肿瘤活性研究认领

作者：

董鹏

学位授予单位：

山东大学

摘要：

多西他赛(Docetaxel,DTX)已广泛用于治疗多种癌症。然而,DTX水溶性差,临床用DTX注射液是在非离子表面活性剂聚山梨醇酯80和乙醇中配制而成,从而导致超敏反应和严重的副作用;另外患者注射前要服用苯海拉明等药物进行脱敏处理。将DTX与水溶性强的高分子聚合物进行偶联,可以提高DTX的水溶性,降低毒副作用,是DTX新剂型的主要研发方向。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种高度不饱和的ω-3脂肪酸,能够抑制肿瘤细胞增殖,同时DHA还可以抑制多种肿瘤细胞的耐药性,增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,DHA可以增强DTX的抗肿瘤作用。本论文把DTX和DHA与合成的双功能化右旋糖酐(Dextran)通过化学偶联合成双药偶联物Dextran-DHA-DTX。该反应首先将叠氮赖氨酸和谷氨酸二甲酯盐酸盐同时与右旋糖酐连接生成含有叠氮基团以及负电性的功能化右旋糖酐;之后将DTX的7-OH以及10-OH进行保护,只裸露2'-OH唯一的反应位点;然后以N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸为起始氨基酸,通过保护、脱保护以及酰胺反应等反应连接其他氨基酸及DHA,使其与保护的DTX发生酯化反应,之后脱去7-OH和10-OH的保护,生成含有DTX和DHA的连接臂;最后将DHA-DTX-连接臂与功能化的右旋糖酐通过高效、专一的点击化学共价连接到一起,生成双药偶联物Dextran-DHA-DTX。我们对偶联物的理化性质进行了研究。通过核磁共振氢谱对偶联物中的DTX含量进行确定,DTX含量为13.9%(w/w)。偶联物Dextran-DHA-DTX具有高水溶性,DTX的水溶性为6-7μg/mL,而偶联物中DTX的水溶性为27.1 mg/mL,其水溶性约为DTX的4000倍。通过透射电子显微镜观察该偶联物在水溶液中为球形的纳米颗粒;马尔文粒径仪测定纳米粒的直径为98.0±6.4nm,适合于肿瘤纳米颗粒的治疗;zeta电位为-24.1±1.5mV,表明该偶联物结构比较稳定。该偶联物在大鼠血浆中进行了释放实验,结果表明在8 h时血浆累积释放达到60%,之后趋于平缓;而DTX在0.5 h时即达到最大值,之后缓慢下降,结果表明偶联物在血浆中具有缓释作用。之后进行了偶联物在PBS中的释放实验,偶联物在pH7.4和pH5.7的PBS中在24 h内均缓慢释放,之后趋于平稳,而DTX在12 h时释放达到100%,之后趋于平缓;表明偶联物在人体生理条件下能够持续释放DTX。肿瘤细胞药物吸收实验结果显示,偶联物在乳腺癌细胞MCF-7中持续释放游离的DTX,具有时间依赖性,在0-72 h细胞中游离DTX和总DTX含量逐渐升高,然后开始降低;与原型药DTX不同的是,在1 h和3 h时偶联物处理的细胞中游离DTX含量明显低于原型药DTX,表明偶联物进入细胞后DTX从偶联物中缓慢释放。SRB法进行的细胞增殖抑制实验结果显示,与MCF-7细胞和人肺癌H460细胞共同孵育72h时,DTX的IC50值分别为6.48±2.61 ng/mL和6.03±2.45 ng/mL,偶联物的IC50值分别为9.48±3.12ng/mL和6.92±2.36ng/mL,原型药DTX和偶联物在抑制细胞增殖活性方面没有显著性差异,表明偶联物和原型药DTX具有相似的肿瘤细胞增殖抑制活性。使用乳腺癌细胞4T1构建的Balb/c小鼠荷瘤模型进行了药代动力学和组织分布实验,偶联物与原型药DTX分别以12mg/kg剂量尾静脉给药。药代动力学结果显示,原型药DTX组其最大血药浓度(Cmax)和药时曲线下面积(AUC)分布为1.85±0.20μg/mL 和 14.22±5.38 μg/mL×h,偶联物组 Cmax 和 AUC 分别为 35.46±5.22 μg/mL 和129.38±12.05 μg/mL×h;另外偶联物的半衰期和清除率与原型药DTX相比较也有显著性差异,结果表明Dextran-DHA-DTX偶联物比原型药DTX组具有更高的浓度和更长的血液循环时间。组织分布结果显示,原型药DTX给药组肿瘤中游离DTX含量在0.5 h时最高,然后迅速下降;而偶联物组肿瘤中游离DTX含量在12 h时达到最高、然后缓慢下降。在给药12、24和96 h时偶联物组肿瘤中游离的DTX含量是原型药DTX组的5.69、6.88和2.75倍,并且偶联物组在脾、肺中的DTX含量低于原型药DTX组,表明Dextran-DHA-DTX偶联物相较于DTX能够在肿瘤中聚集,在正常组织中的分布减少,具有肿瘤靶向性和组织选择性。Dextran-DHA-DTX偶联物在H460和MCF-7两种异种移植瘤裸鼠模型中均表现出优异的治疗效果。当给药剂量为6 mg/kg,每周给药1次,给药4次时,偶联物组在H460裸鼠模型中的抑瘤率为36.8%,显著高于同等剂量下DTX的抑瘤率(19.6%);在12 mg/kg剂量组,偶联物抑瘤率为58.8%,且没有引起裸鼠体重的下降,各正常组织的组织切片没有明显的病变,而预实验结果显示12mg/kg原型药DTX会导致裸鼠死亡或者体重下降超过20%,表明偶联物具有较高的抗肿瘤活性和安全性。在乳腺癌细胞MCF-7裸鼠模型中,12 mg/kg偶联物抑瘤率为99.8%,几乎可以使肿瘤完全消失,且没有引起裸鼠体重下降,表明该偶联物对MCF-7乳腺癌肿瘤具有极强的抑制作用。综上所述,合成的双药偶联物Dextran-DHA-DTX载药量高,形成的纳米颗粒均匀,结构稳定,具有高溶解性、缓释性、肿瘤靶向性、高抗肿瘤活性和低毒性等特点,具有继续研究和开发的价值。

摘要译文

关键词：

多西他赛; 右旋糖酐; 二十二碳六烯酸; 纳米颗粒; 偶联物

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

生物工程（专业学位）

导师：

师以康

中图分类号：

R943[制剂学]

学科分类号：

083611[医药生物工程];100603[中西医结合药学];100702[药剂学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2022.000401