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靶向于HIV-1衣壳蛋白以及SARS-CoV-2主蛋白酶的抗病毒先导化合物的发现认领

被引量： 1

作者：

李敬

学位授予单位：

山东大学

摘要：

病毒感染对人类生命健康的危害非常严重。艾滋病,是一种由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引发的慢性感染性疾病,它可以破坏人体的免疫系统。由于HIV-1易产生耐药性且具有潜伏性,现阶段没有药物可以治愈艾滋病,因此亟需研发出新靶标、新机制的抗HIV-1药物。新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)所引起的呼吸道传染病,自2020年爆发以来,对全球人类健康和社会经济发展带来重大不利影响。当前新冠疫情现状仍不容乐观,多种病毒变异株的出现使得现有疫苗和中和抗体的临床疗效显著降低,因此研发出高效抗耐药性的抗SARS-CoV-2特异性药物具有重要意义。本论文针对HIV-1的耐药性和SARS-CoV-2缺乏特异性治疗药物的科学问题,聚焦于HIV-1的新靶标衣壳蛋白和SARS-CoV-2的关键靶标主蛋白酶,采用基于靶标的药物设计策略,并结合多样性的合成方法,最终发现了多个抗病毒活性良好的先导化合物。主要工作内容分为以下三部分:一、基于多组分反应发现新型类肽类HIV-1衣壳蛋白抑制剂HIV-1衣壳蛋白(Capsid Protein,CA)是构成形态成熟、具有感染性病毒颗粒所必需的结构蛋白,在病毒生命周期的早期(脱壳、逆转录、核输入、整合等)和晚期(组装和成熟)阶段均扮演着重要角色,是目前研究的热点。本文第二章选择靶向于CANTD-CTD的PF-74为先导化合物,通过合理药物设计,结合Ugi四组分反应最终得到了 18个类肽类目标化合物。体外抗HIV活性测试(MT-4细胞)结果显示,当R1为取代苄基,R2为取代的吲哚基团或取代的四氢吲唑基团时,如化合物I-7、I-9、I-19、I-21,其对HIV-1具有较好的抑制活性(EC50=2.53-2.93 μM)。其中化合物I-19表现出最好的抗 HIV-1 活性(EC50(HIV-1)=2.53±0.84 μM,CC50=107.61±27.43 μM)。当 R2 为 1 位萘环取代时,如化合物 I-8(EC50(HIV-2)=5.87±1.79μM,CC50>191.35μM)和化合物 I-14(EC50(HIV-2)=2.30±0.11 μM,CC50>189.32 μM),其对 HIV-2的抗病毒活性优于上市药物奈韦拉平(EC50(HIV-2)>15.02 μM,CC50>15.2 μM),值得进一步开发。分子动力学模拟实验进一步阐明了代表性化合物I-19与靶标的结合模式,为进一步的结构优化奠定了基础。二、基于点击化学微量合成和快速筛选技术发现新型SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂SARS-CoV-2主蛋白酶(Main Protease,Mpro)是一种半胱氨酸蛋白酶,对病毒的复制和转录至关重要。主蛋白酶在冠状病毒中高度保守,并且在人体内无同源性酶,是抗新冠病毒药物研究的热点靶标。本文第三章以SARS-CoV-2主蛋白酶靛红类衍生物D-75为先导化合物,针对D-75细胞活性差、毒性大(EC50>4 μM,CC50=33.1 μM)的问题,通过基于片段的药物设计策略,保留吲哚2,3-二酮优势片段,运用生物电子等排策略将萘环替换为三氮唑结构,并结合点击化学快速微量合成了 58个化合物(粗品)。酶水平的初筛结果显示,在1μM浓度下,目标化合物D71N8、D71N18和D71N52对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制率均达到了 70%以上。经毫克级制备及纯化后,复筛结果表明化合物D71N8(IC50=0.44±0.12 μM)和D71N52(IC50=0.53 ± 0.21μM)的抑酶活性与先导化合物D-75(IC50=0.30±0.14 μM)相当,化合物D71N18(IC50=1.12±0.54μM)的抑酶活性略弱于D-75。细胞水平的抗SARS-CoV-2活性结果表明,目标化合物D71N8、D71N18和D71N52在20μM浓度下没有明显细胞毒性,与先导化合物D-75相比(CC50<2.2 μM)明显下降,然而这三个化合物也未表现出对SARS-CoV-2的抑制活性。此外,通过分子动力学模拟实验探讨了化合物D71N8与SARS-CoV-2主蛋白酶的结合模式。综上,通过将疏水性的萘环替换为三氮唑环,化合物在保持靶标亲和力的同时,细胞毒性大幅降低,为后续结构优化提供了依据。三、基于靶标的新型依布硒啉类SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂的设计、合成以及生物活性评价新型抗炎药物依布硒啉(Ebselen)对SARS-CoV-2具有较好的抑制活性,且目前处于治疗新冠的临床Ⅱ期阶段。结构生物学研究表明依布硒啉是通过硒原子和SARS-CoV-2 Mpro半胱氨酸的巯基形成共价键来抑制Mpro活性。但人体蛋白中的巯基众多,这种与巯基结合的抑制剂缺乏特异性,极易产生脱靶效应。本章以依布硒啉为先导化合物,利用基于靶标的药物设计策略,在靶向S1腔的苯环侧链引入富含氢键供受体的基团,以期通过增强分子与Mpro活性位点的相互作用而增加靶标选择性,设计合成了 1 4个结构新颖的苯并异硒唑酮衍生物。抑酶活性结果表明,化合物Ⅲ-13(IC50=0.38±0.19μM)和Ⅲ-15(IC50=0.50±0.04 μM)的抑酶活性优于依布硒啉(IC50=0.62±0.08μM),化合物Ⅲ-14的活性(IC50=0.68±0.08 μM)与依布硒啉相当。细胞水平的抗新冠病毒活性结果表明,化合物 Ⅲ-15(EC50=17.26±0.13μM)与依布硒啉(EC50=3.78±2.1μM)相比,仍具有一定的差距。值得注意的是,苯环对位的N,N-二甲基磺酰胺基修饰会显著影响细胞毒性,如化合物Ⅲ-13(CC50=6.44±0.31 μM),具有较大的细胞毒性。此外,机制实验(DTT依赖性实验和时间依赖性实验)表明该系列化合物可与主蛋白酶共价结合,且呈时间依赖性。总之,该研究丰富了依布硒啉系列化合物的构效关系,为进一步的结构优化提供参考。综上所述,本研究针对目前抗艾滋病及抗新冠药物的重大临床需求,分别以对病毒复制至关重要的衣壳蛋白和主蛋白酶为靶标,运用合理的药物设计策略、采用微量合成及快速筛选技术,发现了结构新颖、活性良好的HIV衣壳蛋白抑制剂及SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂,对研发出高效低毒的抗病毒候选药物奠定了坚实的基础。

摘要译文

关键词：

HIV-1; SARS-CoV-2; 衣壳蛋白; 主蛋白酶; 药物设计; 药物筛选

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

药物化学

导师：

展鹏

中图分类号：

R914[药物化学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];100701[药物化学];100705[微生物与生物技术药物学]

D O I：

10.27272/d.cnki.gshdu.2022.005382