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基于ROS/自噬途径探讨杨桃根DMDD对小鼠糖尿病心肌病的作用及机制认领

作者：

吴娅妮

学位授予单位：

广西医科大学

摘要：

目的: 探讨杨桃根单体化合物2-十二烷基-6-甲氧基-2,5-二烯-1,4-环己二酮(2-dodecyl-6-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione,DMDD)对糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)小鼠的影响及其作用机制。方法: 雄性C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后,喂以4周高糖高脂饲料。4周后,小鼠禁食12h,腹腔注射链脲佐菌素(STZ)100mg·kg-1(STZ溶于p H=4.4的0.1mol/L柠檬酸盐缓冲液中),检测空腹血糖及心功能生化指标确认造模成功。将造模成功的小鼠随机分为糖尿病心肌病模型组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤组(3-Methyladenine,3-MA,15mg/kg)、抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸组(N-Acetyl-L-cysteine,NAC,100mg/kg)、DMDD高(50mg/kg)、中(25mg/kg)、低剂量组(12.5mg/kg)。另设空白组,予普通饲料喂养。各组小鼠给予相应药物灌胃,空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水,持续干预8周。给药结束后,检测小鼠空腹血糖(FBG),称体质量(BW),摘除眼球收集血液,颈椎脱臼处死小鼠,取心脏组织。检测空腹胰岛素(FINS)、血清甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)、肌酸激酶(CK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH);试剂盒法检测心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)等氧化及抗氧化物活性,ELISA检测心肌组织ROS活性;行苏木素-伊红(H&E)染色、天狼星红染色观病理变化及纤维增生情况;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况,q-PCR和Western Blot检测Bcl-2、Bax、Caspase-3等凋亡因子的m RNA和蛋白表达;透射电子显微镜(TEM)观察自噬体形成;分别使用q-PCR和Western Blot检测LC3II、Beclin-1、Agt5等自噬标志性因子m RNA和蛋白表达水平,以及PI3K/Akt/mTOR通路激活情况。结果: 1.DMDD改善DCM小鼠糖脂代谢异常与模型组相比,DMDD给药组FBG明显降低,胰岛素抵抗有所改善;同时DMDD能够调节DCM小鼠血脂水平,显著地降低血清中的TG、TC、LDL-C水平(P<0.05或P<0.01)。 2.DMDD改善DCM小鼠心肌损伤高糖高脂饲料联合腹腔注射小剂量STZ方法成功复制小鼠糖尿病模型。给予DMDD干预8周后,与模型组相比,DMDD给药组血清中CK、CK-MB、LDH、AST水平显著下降(P<0.05或P<0.01),心肌组织重量减轻。心肌组织病理检查结果显示,模型组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱,胶原纤维明显增加,DMDD给药组小鼠心肌细胞排列较为整齐,纤维增生明显减少。 3.DMDD减轻DCM小鼠心肌组织氧化应激与模型组相比,DMDD显著升高小鼠心肌组织中的SOD、GSH水平,降低MDA含量(P<0.05或P<0.01),提示DMDD能减轻DCM小鼠心肌组织氧化应激损伤。 4.DMDD减少DCM小鼠心肌细胞凋亡 TUNEL染色检测小鼠心肌细胞凋亡,结果可见模型组小鼠凋亡的心肌细胞明显增多,经过DMDD干预之后,DMDD给药组小鼠心肌细胞凋亡数量明显下降。q-PCR和Western Blot法分别检测了凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3 m RNA和蛋白表达,结果显示,与模型组相比,DMDD给药组能显著降低Bax、Caspase-3 m RNA和蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01),而增加Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。提示,DMDD能显著减轻DCM小鼠心肌细胞凋亡。 5.DMDD抑制DCM小鼠心肌组织ROS活性 ELISA试剂盒检测ROS结果显示,与模型组小鼠相比较,DMDD治疗组小鼠的心肌组织内ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01),提示,DMDD能抑制小鼠心肌组织中的ROS活性。 6.DMDD调控DCM小鼠心肌细胞自噬心肌组织TEM分析结果可见模型组小鼠有较多自噬体形成;经DMDD干预后,小鼠心肌组织中的自噬体生成减少。q-PCR和Western Blot结果显示,DMDD给药组的LC3II、Beclin-1、Agt5 m RNA和蛋白表达水平较模型组明显下降(P<0.05或P<0.01)。 7.DMDD调控ROS/自噬PI3K/Akt/mTOR信号通路实验结果显示模型组小鼠心肌组织中p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平显著上调,PTEN蛋白表达明显下调(P<0.05或P<0.01)。而经过DMDD的干预之后,p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达被明显上调,同时下调PTEN蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。q-PCR结果显示,与空白组相比,模型组小鼠心肌组织中的PI3K、Akt、mTOR m RNA表达水平显著下降,PTEN m RNA表达水平上升,而DMDD干预之后能够显著逆转这些基因的异常表达(P<0.05或P<0.01)。以上实验结果提示,DMDD可能通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,调控心肌细胞自噬。结论: DMDD能够减轻糖尿病所致的心肌损伤,其可能的机制与DMDD减轻心肌组织氧化应激、降低ROS水平、减少心肌细胞凋亡,调控ROS介导的自噬PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。

摘要译文

关键词：

糖尿病心肌病; DMDD; ROS; 自噬; PI3K/Akt/mTOR信号通路

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

药理学

导师：

张士军

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27038/d.cnki.ggxyu.2021.000482