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TGF-β1通过kisspeptin调控人胎盘滋养层细胞侵袭的机制研究认领

作者：

闫阳

学位授予单位：

郑州大学

摘要：

背景:Kisspeptin是KISS-1基因编码的多肽类激素,2001年由Kotani等在研究肿瘤细胞转移机制的过程中首次发现,也被称为转移抑制素。作为促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)的上游调节因子,其与G蛋白偶联受体-54(G protein-coupled receptor 54,GPR-54)结合,进而在调控下丘脑-垂体-卵巢轴(Hypothalamus-pituitary-ovary axis,HPOA)的功能方面发挥重要作用。Kisspeptin通过介导雌激素的正负反馈来调节Gn RH的分泌,继而影响青春期启动、性分化、能量代谢等生命过程,在女性生殖系统活动中具有重要作用。近年来有研究表明,kisspeptin/KISS1R系统在滋养层细胞的侵袭和迁移中发挥着不可替代的作用。转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族相关蛋白在机体内分布广泛,参与免疫调节、类固醇激素合成、细胞内稳态维持、卵泡募集及排卵等多项关键生理活动。TGF-β1是TGF-β亚家族中功能极为多样的一员,在结缔组织细胞、内皮细胞和造血细胞中均有表达。研究表明,TGF-β1在卵母细胞发育、类固醇激素生成及胚胎发育等生殖生理过程中均扮演着重要角色。绒毛外滋养层细胞(Extravillous trophoblast,EVT)的正常侵袭是维持胎盘功能和妊娠的关键。EVT细胞侵袭不足会导致子痫前期(Preeclampsia,PE)的发生,进而可能引发孕产妇围产期的死亡。TGF-β1和kisspeptin在人胎盘中表达,均已被证明可以抑制EVT细胞的侵袭。Kisspeptin是人乳腺癌细胞中TGF-β1的下游靶点,然而在人胎盘滋养层细胞中,kisspeptin是否受TGF-β1调控,并介导TGF-β1对人EVT细胞侵袭的抑制过程尚不清楚。目的:探讨kisspeptin在TGF-β1抑制人胎盘滋养层细胞侵袭过程中的作用及其分子机制,并研究TGF-β1和kisspeptin在PE患者血清中的表达情况。方法:1.本研究的细胞模型为人EVT细胞系HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞,后者是通过对人工流产患者胎盘绒毛组织分离培养得到的。2.通过实时荧光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)和Western blot技术检测不同浓度、不同时长的TGF-β1处理对HTR-8/SVneo细胞kisspeptin mRNA和蛋白表达的影响,以及用特异性受体抑制剂预处理HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞后,TGF-β1对kisspeptin表达的影响是否改变。3.通过RT-qPCR、Western blot及siRNA转染技术检测HTR-8/SVneo细胞中SMAD2和SMAD3能否被TGF-β1激活,以及敲除内源性SMAD4后,TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的影响。4.用ERK1/2和AKT信号通路的抑制剂分别预处理HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞后,通过RT-qPCR和Western blot技术检测TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的影响。5.通过siRNA转染和Transwell侵袭试验检测敲除内源性kisspeptin对HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞的侵袭性的影响。6.利用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测PE患者及正常孕妇血清样本中TGF-β1和kisspeptin水平,样本来源于同一时期就诊于我院产科的患者。7.实验结果采用PRISM 5统计软件包进行分析。符合正态分布的连续型变量用“平均值±标准差”描述,两组间比较采用独立样本T检验,多重分析选用One Way ANOVA和Tukey法。P<0.05时认为有统计学差异。结果:1.在HTR-8/Svneo细胞中,5ng/mL和10ng/mL TGF-β1分别作用12h、24h均可显著上调kisspeptin mRNA和蛋白水平。使用特异性TGF-βI型受体(ALK5)抑制剂SB431542预处理,可阻断TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。应用ALK5 siRNA敲低内源性ALK5表达,可抑制TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。2.在HTR-8/SVneo细胞中,5ng/mL TGF-β1处理可以激活细胞内SMAD2和SMAD3。应用SMAD4 siRNA敲低内源性SMAD4表达,并不影响TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。3.在HTR-8/SVneo细胞中,5ng/mL TGF-β1处理可以激活细胞内ERK1/2和AKT信号通路。应用MEK1/2抑制剂(U0126)阻断ERK1/2信号通路的激活,可阻断TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用;应用PI3K抑制剂(LY294002)阻断AKT信号通路的激活,不影响TGF-β1对kisspeptin mRNA和蛋白水平的促进作用。4.在人原代培养的EVT细胞中,5ng/mL TGF-β1处理显著上调kisspeptin蛋白水平。使用SB431542和U0126分别预处理,均可阻断TGF-β1对kisspeptin蛋白水平的促进作用。5.Transwell侵袭试验表明,5ng/mL TGF-β1以及1μM kisspeptin能显著抑制HTR-8/SVneo细胞的侵袭性。在HTR-8/SVneo细胞和人原代培养的EVT细胞中,应用kisspeptin siRNA敲低内源性kisspeptin表达后,TGF-β1对kisspeptin蛋白水平的促进作用消除,同时TGF-β1对细胞侵袭的抑制作用减弱。6.和正常孕妇相比,PE患者血清TGF-β1和kisspeptin水平显著升高(22.41±8.44 ng/mL vs.13.87±6.39 ng/mL,P<0.001;88.26±35.80 pg/mL vs.59.31±35.08 pg/mL,P=0.006)。结论:1.在人EVT细胞中,TGF-β1通过ALK5上调kisspeptin表达。2.在人EVT细胞中,TGF-β1通过活化ERK1/2信号通路而非SMAD信号通路上调kisspeptin表达。3.Kisspeptin介导了TGF-β1对人EVT细胞侵袭的抑制作用。4.PE患者血清TGF-β1和kisspeptin水平上调,提示与PE患者EVT细胞侵袭性减弱密切相关,为PE发病机制的研究提供了新思路。

摘要译文

关键词：

TGF-β1; 人胎盘滋养层细胞; 侵袭; kisspeptin; 子痫前期

学位年度：

2022

学位类型：

硕士

学科专业：

妇产科学（生殖医学）（专业学位）

导师：

孙莹璞方兰兰

中图分类号：

R714[产科学⑨]

学科分类号：

100208[妇产科学]

D O I：

10.27466/d.cnki.gzzdu.2022.004621