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Nrf2-ARE信号通路介导的桑叶黄酮缓解马骨骼肌卫星细胞氧化应激的机理研究认领

被引量： 6

作者：

曹迪

学位授予单位：

内蒙古农业大学

摘要：

现代马产业逐步转变为融合畜牧、金融、文化、体育为一体的新型产业。从桑树属和桑科植物中提取的生物质被认为是一种潜在的家畜饲料资源,黄酮作为桑叶中发挥主要功效的成分之一,主要起到抗氧化以及清除自由基的效果。本试验通过不同工艺提取桑叶中的黄酮,并对提取出的黄酮类化合物进行总黄体酮得率检测及成分鉴定,在此基础上筛选缓解马骨骼肌卫星细胞氧化应激的最佳桑叶黄酮提取工艺及最佳添加浓度,并研究Nrf2-ARE信号通路介导的桑叶黄酮对缓解马骨骼肌卫星细胞氧化应激的机理,为针对桑叶黄酮进行进一步的研究以及缓解马运动过程中的氧化应激提供理论基础。试验一:桑叶黄酮的提取、体外抗氧化性能检测及成分鉴定通过3种不同工艺对桑叶中的黄酮进行提取,提取方法分别为超声辅助粗提取,AB-8大孔树脂纯化提取以及正丁醇萃取,最终得到3种工艺产物分别为超声辅助粗提取(CEP),AB-8大孔树脂纯化提取物(RP)以及正丁醇萃取产物(Nb-EP)。对3种不同工艺提取产物进行黄酮得率的测定,测定结果分别为CEP组为32.20%,RP组为37.94%,Nb-EP组为40.96%。通过DPPH自由基清除率对三种桑叶黄酮工艺提取产物进行体外抗氧化指标的检测,CEP组DPPH自由基清除率达到89.30%,PR组为90.62%,Nb-EP组为90.32%。对得到的三种工艺提取物进行非靶向代谢测序、根据黄酮的化学结构进行分类,并且筛选出差异代谢物。其中甘草素,杨梅酮,新补骨脂异黄酮为CEP组所特有的黄酮类物质;Nb-EP组特有的黄酮类代谢物质为白杨素,新藤黄酸,RP组无特有黄酮类物质。试验二:3种不同的工艺桑叶黄酮对马骨骼肌卫星细胞氧化应激的缓解作用使用3种工艺桑叶黄酮提取物不同浓度预保护24h后,添加过氧化氢600umol/L处理6h(氧化应激模型)后,进行了细胞形态的初步观察。结果表明:CEP组0.6-0.8mg/ml浓度条件下对细胞形态保护作用最佳,RP和Nb-EP组浓度在0.4-0.6mg/ml时对细胞形态保护作用较优;利用CCK8和MTT试剂盒按照说明进行细胞活力的检测,最终筛选出3种不同工艺桑叶黄酮提取物的最优浓度,分别为CEP组0.8mg/ml,RP组0.6mg/ml和Nb-EP组0.6mg/ml。试验三:Nrf2-ARE信号通路介导的桑叶黄酮缓解马骨骼肌卫星细胞氧化应激调控的机理设计与Nrf2-ARE通路相关的基因特异性引物,通过相关抗氧化基因的相对表达量以及下游调控抗氧化酶活性,进而确定Nrf2-ARE信号通路介导桑叶黄酮调控蒙古马骨骼肌卫星细胞氧化损伤的机理。分别构建马骨骼肌卫星细胞的空白组,过氧化氢模型组以及筛选好的3种桑叶黄酮工艺提取物的最优浓度组(处理组)进行试验。结果表明:氧化应激模型组细胞与空白组细胞相比Nrf2基因的表达量显著下降(P<0.01),下游相关基因SOD1、SOD2、GPX1、GPX3和Trx R1空白组细胞与模型组细胞相比,基因的表达量显著上调(P<0.01)。当添加0.8mg/ml CEP后,Nrf2基因的表达量与模型组细胞相比极显著上升(P<0.01);除SOD2基因外,其他抗氧化相关基因的表达量与模型组细胞相比极显著上升(P<0.01)。当添加RP组0.6mg/ml浓度桑叶黄酮进行预处理后与氧化应激模型组细胞相比,Nrf2基因的表达量和下游相关基因的表达量极显著上升(P<0.01),添加0.6mg/ml Nb-EP后,Nrf2基因及其下游调控基因变化情况与0.6mg/ml RP组相同,各基因表达量极显著上调(P<0.01)。抗氧化相关酶活性结果表明,空白组相较于模型组,GSH-Px、SOD均显著上调,总抗氧化能力上升不明显,当添加浓度为CEP0.8mg/ml,RP组0.6mg/ml和Nb-EP 0.6mg/ml对马骨骼肌卫星细胞预保护后,与氧化应激模型组相比,相关抗氧化酶GSH-Px、SOD活性显著增加,MDA下调极显著(P<0.01)。同时,添加不同工艺最优浓度桑叶黄酮进行预保护,结果表明,相对于氧化应激模型组细胞,桑芽黄酮添加组的细胞耗氧率以及细胞体外酸化速率均显著上调。综上所述,结果表明:0.8mg/ml CEP、0.6mg/ml RP和0.6mg/ml Nb-EP作为桑叶黄酮3种提取产物分别确定的最优浓度,可以通过Nrf2-ARE信号通路的介导SOD1、SOD2、GPX1、GPX3和Trx R1抗氧化基因表达,进而提高SOD和GSH-Px,抗氧化酶活性,降低MDA含量,且提升细胞线粒体呼吸能力,进而达到缓解马骨骼肌卫星细胞的氧化损伤的作用。

摘要译文

关键词：

马; 桑叶黄酮; 骨骼肌卫星细胞; 氧化应激; Nrf2-ARE信号通路

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

畜牧（专业学位）

导师：

芒来张心壮

中图分类号：

S853.74[中兽医药理学]

学科分类号：

090604[动物药学];090605[中兽医学]

D O I：

10.27229/d.cnki.gnmnu.2021.000709