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抗菌肽Mastoparan-C新型类似物的设计、合成、构效关系及其抑制和逆转抗生素耐药性作用研究认领

被引量： 4

作者：

朱宁艺

学位授予单位：

兰州大学

摘要：

抗生素耐药性被世界卫生组织认为是21世纪最重要的三大公共卫生威胁之一。为了解决抗生素耐药性问题,开发新型抗生素或新的治疗方案迫在眉睫。抗菌肽由于其独特的膜溶解作用机制和不易产生耐药性的特点而引起了广泛关注。Mastoparan-C（MP-C）是从欧洲大黄蜂（Vespa crabro）的毒液中分离出来的一种典型的阳离子α-螺旋抗菌肽,具有很强的广谱抗菌活性。然而,MP-C对正常哺乳动物细胞的高细胞毒性,严重限制了其直接作为抗菌药物的应用。本研究的第一部分工作为了降低MP-C的细胞毒性并探究其构效关系,采用氨基酸替换和肽链截短策略合理设计、合成了24条MP-C类似物。实验结果表明,大部分类似物都保留了MP-C的广谱抗菌活性,且毒性显著降低。研究发现,疏水性是控制类似物生物活性的主要因素,疏水性降低,抗菌活性和细胞毒性随之降低。随后,我们筛选出了3条最具潜力的类似物L1G、L7A和L1GA5K并进行了安全性、稳定性和作用机制等系统评估。结果显示,3条类似物都具有较低的细胞毒性和低诱导耐药性,并在生理盐和蛋白酶环境中具有较高的稳定性。此外,3条类似物与传统抗生素联合用药对抗革兰氏阴性菌均表现出协同或增效作用。杀菌动力学、内外膜渗透性、扫描电镜和PI摄取结果表明,3条类似物能以浓度和时间依赖性方式破坏细胞膜,导致膜渗透性改变和细胞内容物泄露,在短时间内快速杀灭细菌。另外,治疗指数最高的类似物L1GA5K对利福平耐药大肠杆菌（RRE）表现出较强的抗菌活性。L1GA5K与利福平联用使用可抑制大肠杆菌对利福平耐药性的产生,并能通过增强细菌外膜通透性逆转RRE对利福平的耐药性。总之,MP-C类似物不仅自身具有较强的广谱抗菌活性,而且还能作为抗生素佐剂抑制和逆转抗生素的耐药性。本研究的第二部分工作进一步探索了L1GA5K作为抗生素佐剂抑制和逆转抗生素耐药性的作用。实验结果表明,L1GA5K可以抑制利福平在革兰阴性菌中耐药性的产生,也可抑制庆大霉素在革兰阴性菌中（除铜绿假单胞菌之外）耐药性的产生。另外,L1GA5K对一系列利福平和庆大霉素耐药菌株具有较强的抗菌活性,并且能够在亚抑制浓度下逆转耐药菌对利福平或庆大霉素的耐药性,使细菌对已耐药抗生素重新敏感。初步作用机制研究显示,L1GA5K主要通过增强细菌外膜渗透性,使细胞内抗生素浓度增加,从而抑制和逆转抗生素耐药性,而与外排泵抑制作用无关。除了抑制和逆转抗生素耐药性之外,L1GA5K与不同抗生素联合使用还具有协同或增效作用,能显著增强抗生素的抗菌活性。杀菌动力学实验表明,L1GA5K能够在短时间内快速杀死抗生素耐药菌,且杀菌速度明显优于传统抗生素,与传统抗生素联合使用后还可加快抗生素的杀菌速度。除此之外,L1GA5K还能抑制细菌生物膜的形成,这将有利于L1GA5K抑制和逆转抗生素耐药性。总之,L1GA5K与抗生素联合用药能增强抗生素的抗菌活性、提升抗生素的杀菌速度,还能通过增强细菌外膜渗透性抑制和逆转抗生素在革兰阴性菌中的耐药性,是较理想的抗生素佐剂候选化合物。本研究的第三部分工作采用不同电荷排列模式和不同带电氨基酸种类的修饰策略设计、合成了11条L1GA5K类似物,对L1GA5K进行了进一步优化,期望得到具有更高细胞选择性的类似物。实验结果表明,类似物K-1具有比L1GA5K更强的抗菌活性、更低的细胞毒性,说明电荷聚集于肽链N端的排列模式可能是降低抗菌肽细胞毒性并保留抗菌活性的一种可行方法。另外,酶解稳定性实验结果表明,K-1在胰蛋白酶中的稳定性相比L1GA5K提高了10倍。K-1与传统抗生素联合对抗大肠杆菌和铜绿假单胞菌均具有协同或增效作用,并能在短时间内将细菌杀死,表现出快速杀菌作用。内外膜渗透性、扫描电镜、PI摄取和DNA泄露实验结果表明,K-1能破坏细菌细胞膜,增强细菌外膜渗透性,导致细胞内容物泄露而发挥抗菌作用。然而,K-1对细菌内膜渗透性仅表现出微弱的影响,说明电荷排列模式不同可能会导致抗菌肽作用机制的改变。综上所述,为了降低MP-C的毒性、研究其构效关系,我们递进式设计合成了一系列类似物,筛选出了3条具有较高抗菌活性和低溶血活性的类似物,并进行了安全性、稳定性、作用机制等系统评估。然后,考察了最优类似物L1GA5K作为抗生素佐剂抑制和逆转抗生素耐药性的潜能。同时,通过对L1GA5K进一步优化,得到了活性和稳定性更强、毒性更低的类似物K-1。本研究为今后抗菌肽设计改造提供了新的思路和方法,也为抗菌肽作为抗生素佐剂抑制和逆转抗生素耐药性提供了一定的依据和参考。

摘要译文

关键词：

抗菌肽; Mastoparan-C; 抗菌活性; 细胞毒性; 抗生素耐药性; 抗生素佐剂

学位年度：

2021

学位类型：

硕士

学科专业：

药学

导师：

倪京满

中图分类号：

R91[药物基础科学]

学科分类号：

100603[中西医结合药学];1007[药学]

D O I：

10.27204/d.cnki.glzhu.2021.000478