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GABAARα1-TLR4通路在癫痫-偏头痛共病中的作用机制研究认领

作者：

林尧

学位授予单位：

武汉大学

摘要：

目的:癫痫和偏头痛在临床特征、先兆症状、发病机制、治疗方式等方面均具有相似之处,而且二者容易共病。但是由于缺乏动物模型,目前癫痫和偏头痛的共病研究主要集中在临床方面,本研究拟采用我们此前建立的癫痫易化偏头痛大鼠模型,探讨癫痫/偏头痛共病的病理生理机制。基因机制为癫痫/偏头痛共病的公认机制,而对于数量更多的散发性癫痫/偏头痛共病患者,炎性机制的可能性最大。有研究发现Toll-like receptor 4(TLR4)诱导固有免疫,刺激炎性细胞因子产生,参与偏头痛和癫痫的病理过程。我们前期关于癫痫和偏头痛的单病研究发现,大鼠痫性发作和偏头痛样发作后,均可见GABAARα1表达降低。因此,本研究采用此前建立的癫痫易化偏头痛大鼠模型,以炎性机制作为癫痫/偏头痛共病的切入点,选取颞叶皮层、海马为癫痫感兴趣区,三叉神经节、延髓背角神经元为头痛感兴趣区,探讨GABAARα1-TLR4通路在疾病中的可能作用机制及上下游关系。方法:1.动物模型建立:手术暴露大鼠上矢状窦旁硬脑膜,放置导管,腹腔注射(Intraperitoneal,I.P)氯化锂-匹鲁卡品(Lithium chloride-pilocarpine),建立大鼠癫痫模型;随后,每日从导管给予炎性汤(Inflammatory soup,IS)刺激硬脑膜,建立大鼠偏头痛模型。2.分组:将大鼠随机分为对照组、偏头痛组、癫痫组、癫痫-偏头痛共病组(简称共病组)。3.行为学方法:腹腔注射匹鲁卡品,诱发痫性发作后,观察大鼠痫性发作的潜伏期和最大发作级别;给予炎性汤刺激硬脑膜,诱导偏头痛样发作后,观察大鼠挠头次数,用von-Frey纤维丝测量面部机械痛阈值。4.蛋白免疫印迹法:将各组大鼠的组织匀浆裂解,离心后提取蛋白液,通过BCA法测定浓度,算出上样量,SDS-PAGE电泳后转膜,脱脂牛奶封闭,按目的蛋白分子量大小分别孵育一、二抗,最后扫膜计算灰度值,比较组间差异。5.组织免疫荧光法:将各组大鼠脑组织切片进行抗原修复,免疫组化笔小心沿组织块画圈后,滴入组织自发光淬灭剂,湿盒中封闭后,分别孵育一、二抗,最后封片,荧光显微镜下阅片拍照,计算荧光强度值,比较组间差异。6.免疫共沉淀法:将共病大鼠的延髓背角组织匀浆裂解,提取蛋白液,目的蛋白抗体与相应种属IgG(阴性对照组)与蛋白液按1:50比例加好,孵育后加入protein A/G琼脂糖磁珠,再次孵育后用PBS充分洗涤,离心去除上清液,进行SDS-PAGE电泳,转膜,抗体孵育,最后扫膜显影,检测GABAARα1和TLR4是否可形成受体异聚复合物。7.药物干预:观察GABAAR激动剂Muscimol和TLR4拮抗剂TAK-242干预后,共病组、共病+Muscimol组和共病+TAK-242组的行为学差异,包括偏头痛行为学(挠头次数和面部机械痛阈值),癫痫行为学(癫痫发作的潜伏期和Racine分级评分)。WB检测颞叶皮层、海马、延髓背角及三叉神经节GABAARα1和TLR4蛋白表达水平,比较组间差异。结果:1.与对照组比较,偏头痛组大鼠挠头次数增加,面部机械痛阈值下降,差异有统计学意义(P<0.01),提示炎性汤模型可致大鼠头面部痛觉敏化。与对照组比较,癫痫组大鼠挠头次数和面部机械痛阈值差异无统计学意义(P>0.05),提示单独痫性发作对大鼠头痛行为无影响。与偏头痛组比较,共病组大鼠挠头次数增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示癫痫-偏头痛共病模型比偏头痛模型痛觉超敏更明显。2.与对照组比较,偏头痛组大鼠头痛感兴趣区三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示炎性机制参与大鼠偏头痛样发作。与对照组比较,癫痫组大鼠三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示痫性发作同时也激活了头痛感兴趣区的炎性过程。与偏头痛组和癫痫组比较,共病组大鼠三叉神经节小胶质细胞阳性表达增加,差异有统计学意义(P<0.01),提示共病组的炎性反应比单病组更明显。3.采用蛋白免疫印迹法检测TLR4和GABAARα1表达。与对照组比较,在癫痫感兴趣区颞叶皮层和海马,以及头痛感兴趣区延髓背角和三叉神经节中,偏头痛、癫痫组大鼠TLR4表达水平均升高,偏头痛、癫痫组GABAARα1表达水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与偏头痛和癫痫组比较,共病组大鼠以上区域TLR4表达水平升高,GABAARα1表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示TLR4表达升高,GABAARα1表达降低,在偏头痛/癫痫的单病和共病时均可出现,共病比单病更明显。4.采用组织免疫荧光法检测TLR4和GABAARα1表达与分布。与对照组比较,偏头痛组和癫痫组大鼠颞叶皮层、三叉神经节、延髓背角处TLR4阳性表达升高,GABAARα1阳性表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与偏头痛组和癫痫组比较,大鼠颞叶皮层、三叉神经节、延髓背角处TLR4阳性表达升高,GABAARα1阳性表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),提示TLR4表达升高,GABAARα1表达降低,在偏头痛/癫痫的单病和共病时均可出现,共病比单病更明显。5.采用免疫共沉淀法,发现GABAARα1和TLR4之间有直接相互作用。6.GABAAR受体激动剂Muscimol预处理后,在癫痫-偏头痛共病的癫痫期,大鼠痫性发作潜伏期延长,发作级别下降,差异有统计学意义(P<0.05),提示激活GABAAR可抑制痫性发作。TLR4受体拮抗剂TAK-242预处理后,在癫痫-偏头痛共病的癫痫期,大鼠痫性发作潜伏期和发作级别没有明显改变,差异无统计学意义(P>0.05),提示抑制TLR4对痫性发作无影响。GABAAR受体激动剂Muscimol和TLR4受体拮抗剂TAK-242分别预处理后,在癫痫-偏头痛共病的共病期,大鼠挠头次数均减少,面部机械痛阈值均升高,差异有统计学意义(P<0.01),提示激活GABAAR/抑制TLR4均可抑制偏头痛样发作。7.采用蛋白免疫印迹法,检测颞叶皮层、海马、延髓背角和三叉神经节处GABAARα1和TLR4表达。GABAAR受体激动剂Muscimol预处理后,共病+Muscimol组大鼠较共病组TLR4的表达水平降低,GABAARα1表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。TLR4受体拮抗剂TAK-242预处理后,共病+TAK-242组大鼠较共病组TLR4的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),但GABAARα1表达水平没有显著改变(P>0.05),提示激活GABAAR可逆转共病所致的GABAARα1减少/TLR4增加,抑制TLR4只能逆转共病所致的TLR4增加,对GABAARα1表达无影响。结论:1.癫痫-偏头痛共病模型并不是两个单独疾病的简单叠加,此模型可模拟癫痫易化头痛发作的病理生理过程。2.炎性机制参与癫痫对头痛的易化作用,癫痫-偏头痛共病可导致GABAARα1表达降低,TLR4表达增加。3.GABAARα1和TLR4之间存在直接相互作用。4.GABAARα1减少引起痫性发作,为癫痫-偏头痛共病的始动因素,可导致TLR4表达增加,易化偏头痛样发作。

摘要译文

关键词：

癫痫; 偏头痛; 共病; TLR4; GABAARα1

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

神经病学

导师：

肖哲曼

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨];R747.9[并发神经病⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27379/d.cnki.gwhdu.2020.002305