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中性粒细胞在温热治疗孢子丝菌病中的作用研究认领

作者：

王亚兰

学位授予单位：

中国医科大学

摘要：

背景:孢子丝菌病是中国北方地区常见的真菌病,主要通过接触芦苇和玉米秆时感染球型孢子丝菌引起。孢子丝菌病临床表现多样,包括皮肤播散型、真菌血症、内脏器官播散型、固定型和皮肤淋巴管型,固定型和皮肤淋巴管型是最主要的两种类型。尽管伊曲康唑是治疗孢子丝菌病的首选治疗方案,但治疗花费较高,副作用较大。局部温热也被用于皮肤淋巴管型及固定型孢子丝菌的治疗。对于不能安全接受其他治疗方案的患者,如孕妇和哺乳期妇女,局部热疗是治疗固定型孢子丝菌病较好的选择。尽管局部温热被推荐用于固定型及皮肤淋巴管型孢子丝菌病的治疗,但尚缺乏随机安慰剂对照试验或与其他治疗方法的比较试验,以评估该疗法的有效性和安全性。尤其是一些孢子丝菌病患者有自愈性,更需要证据明确局部热疗是否有效。在孢子丝菌病患者皮损的真皮层及皮下组织有化脓性及肉芽肿性炎症反应,组织病理学检查发现常伴有小脓肿。中性粒细胞是主要的浸润细胞之一,但中性粒细胞在孢子丝菌病的发病机制中的作用尚不清楚。有报道在一些孢子丝菌病的病灶组织中观察到中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成。NETs是染色质的修饰形式,保持着核小体间隔的周期性,颗粒状蛋白以球状形式与NETs相结合结合。许多真菌,比如构巢曲霉、白色念珠菌、杜氏假丝酵母及新型隐球菌都表现出对NETs的敏感性,然而仍不清楚NETs是否有杀伤球形孢子丝菌的作用。本研究旨在评估热疗在孢子丝菌病小鼠模型中的治疗作用,并初步探讨中性粒细胞及NETs是否与孢子丝菌的清除有关。报道如下。材料与方法1、实验对象人中性粒细胞分离自10个健康志愿者的静脉血。静脉血的采集及随后的实验获得中国医科大学附属第一医院机构审查委员会批准,并符合赫尔辛基宣言。球形孢子丝菌菌株来源于一个固定型孢子丝菌病患者,并经ITS测序鉴定为球形孢子丝菌。孢子丝菌病小鼠模型为6-8周周龄、体重19-20g,经皮下注射0.1ml 108/ml的球形孢子丝菌酵母细胞的1周后的BALB/C雌性小鼠。2、温热治疗方案孢子丝菌病小鼠模型治疗方法:采用定制的温热仪器及水球,加热小鼠皮损至41℃。加热期间,用温度计监测小鼠皮肤温度,温度波动于40-41℃。小鼠每天温热治疗30分钟,连续治疗4周。而对照组小鼠不进行温热处理。细胞温热:水浴锅调整至实验设定的温度(37℃和41℃)后,将细胞接种于24孔板中,将24孔板放于水浴锅的水面加热30分钟,30分钟后将细胞重新放于37℃培养箱中培养。3、温热处理后皮损的变化观察并记录治疗前及每治疗1周后小鼠皮损的变化,比较两组皮损宽度的变化。4、免疫组化检测组织中中性粒细胞细胞外诱捕网的形成小鼠温热治疗治疗1周后,处死留取皮疹组织。将组织切片黏附于多聚赖氨酸包被的载玻片上,进行免疫组化染色(SP法),通过检测弹性蛋白酶来观察中性粒细胞细胞细胞外诱捕网是否形成。5、糖原染色检测温热处理对皮损中孢子数量的影响小鼠造模1周后,温热治疗1周后及温热治疗3周后,处死小鼠并留取皮损组织。将组织切片(3um)黏附于载玻片上,用高碘酸-雪夫试剂染色,苏木素复染,在40倍物镜下随机选取多个视野,计数视野内脓腔中孢子的数量,测量脓腔的面积,并计算单位像素面积下脓腔中孢子的数量。6、免疫荧光检测中性粒细胞细胞外诱捕网的形成采用免疫荧光的方法检测中性粒细胞与孢子在不同温度条件下共培养时,中性粒细胞细胞外诱捕网的形成情况。计数中性粒细胞和NETs的数量,并计算NETs的百分率。7、杀伤实验将不同处理后的孢子培养液涂布平板,计数不同组间的集落形成单位数量。计数并比较各组14天后的集落形成单位的数量。8、统计学分析采用SPSS 22软件对数据进行统计分析,利用GraphPad Prim软件进行统计作图。利用Office 2016软件绘制统计表,数据表示为均数±标准差。用重复测量方差分析对治疗期间皮疹的宽度变化的进行统计分析。用Fisher确切概率法比较温热组和对照组小鼠皮损的清除率。温热治疗第三周时,小鼠皮损脓腔中单位像素面积的孢子数量不满足正态分布,因此采用Mann-Whitney test,数据用中位数表示。温热治疗第一周时,小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量满足正态分布,采用独立样本t检验,但数据仍用中位数表示。采用独立样本t检验来评估体外实验时,不同处理后球形孢子丝菌的存活状态及细胞外诱捕的形成率的差异,数据表示为均数±标准误。P<0.05表示差异具有统计学意义。实验结果:1、温热对孢子丝菌病小鼠皮损的影响温热组小鼠与对照组小鼠的皮疹直径的差值(皮疹宽度差值=治疗前皮疹宽度-治疗期间的皮疹宽度)随着治疗时间的延长不断增大,P<0.05;且温热组小鼠皮疹宽度的差值与对照组小鼠皮疹宽度的差值在治疗期间不同,P<0.05,温热组小鼠皮疹宽度的差值高于对照组小鼠,即皮疹消退比对照组小鼠快。温热组治疗停止后2周及3周后痊愈率均高于对照组,P<0.05。2、温热对皮损组织中孢子数量的影响两组小鼠的孢子均局限于皮疹脓腔内。尽管温热组小鼠及对照组小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量都随治疗时间延长明显下降,但是温热组小鼠及对照组小鼠皮疹脓腔中单位像素面积的孢子数量没有明显的差异,P>0.05。3、温热对中性粒细胞细胞外诱捕网形成的影响温热组小鼠和对照组小鼠皮损组织中都可见大量细胞外诱捕网形成。中性粒细胞与孢子在41℃、37℃共培养后,都可以见到细胞外诱捕网的形成,但是细胞外诱捕网形成的率没有差异。4、温热及中性粒细胞对孢子存活状态的影响当酵母细胞与中性粒细胞在41℃和37℃条件下共培养后,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在41℃和37℃条件下培养后,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在41℃条件下和中性粒细胞共培养后,与没有中性粒细胞时相比,两组集落形成单位的数量无明显差异。当酵母细胞在37℃条件下和中性粒细胞共培养后,与没有中性粒细胞时相比,两组集落形成单位的数量无明显差异。用佛波酯诱导的中性粒细胞细胞外诱捕网和孢子共培养后,与中性粒细胞和孢子共培养及加入佛波酯的孢子培养液相比,集落形成单位的数量均没有明显差异。表明体外实验条件下,41℃温热不能杀伤球形孢子丝菌的酵母相细胞,也不能促进中性粒细胞杀伤球形孢子丝菌的酵母相细胞。结论:1、球形孢子丝菌感染的小鼠皮疹具有自愈的能力,但是温热治疗能缩短小鼠皮损的清除时间。2、尽管温热治疗小鼠孢子丝菌病有效,但温热不能直接促进孢子丝菌病小鼠皮损中的孢子的杀伤,也不能提高中性粒细胞对孢子丝菌的杀伤作用。3、球形孢子丝菌酵母细胞可以诱导中性粒细胞NETs的形成。4、温热治疗孢子丝菌病,不依赖于NETs的形成。

摘要译文

关键词：

温热; 球形孢子丝菌; 孢子丝菌病; 中性粒细胞细胞外诱捕网

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

皮肤病与性病学

导师：

高兴华

中图分类号：

R519[真菌与放线菌传染病⑨]

学科分类号：

100201[内科学];100401[流行病与卫生统计学]

D O I：

10.27652/d.cnki.gzyku.2020.000772