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葡萄微管蛋白标记系响应座腔菌属顶枯病胁迫的显微观察及转录组分析认领

被引量： 2

作者：

赵亮

学位授予单位：

西南大学

摘要：

葡萄座腔菌属顶枯病(Botryosphaeria dieback)主要是由葡萄座腔菌科真菌Botryosphaeriaceae引起的,侵染后造成葡萄穗轴干枯、烂果和落粒。近年来,该病害在世界范围内迅速蔓延,对中国、西班牙、法国、意大利和美国等葡萄生产大国在内的20多个国家,都造成了巨大的经济损失。在我国20个葡萄主种植省份均有发生,造成葡萄减产3%-8%,严重地区达10%-20%,个别地区达50%以上。从1998年在葡萄牙首次被报道开始,这些病症的发生频率显著增加,国内外尝试用各种方法和生产技术致力于解决该问题,但从宿主分子细胞生物学角度进行的研究并不深入。而微管作为紧邻细胞膜的一个重要传感器,具有行使在病原入侵初期感知和传导信号的功能,对阐明座腔菌属顶枯病的发病机理,增强生产中葡萄的抗病功能具有重要意义。本研究从2018年3月和7月于山东省蓬莱市采集的感病枝条中分离鉴定葡萄座腔菌属顶枯病疑似病原菌,用病原菌胞外分泌物处理抗病美洲沙地葡萄微管蛋白标记系悬浮细胞(Vitis rupestris expressing GFP-AtTUB6),进行显微观察和转录组测序分析。拟获得感病欧洲葡萄微管蛋白标记系悬浮细胞系。以微管蛋白介导的葡萄细胞早期内源免疫为研究重点,旨在为葡萄抗座腔菌属顶枯病机理研究提供细胞和分子水平研究基础。主要研究结果如下:(1)采用组织分离法从当年感染葡萄座腔菌属顶枯病的葡萄枝条中分离疑似病原菌,采用生物学特性观察以及rDNA-ITS测序方法,分离鉴定出6种真菌:葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea),交链格孢(Alternaria alternata),细极链格孢(Alternaria tenuissima),极细枝孢霉(Cladosporium tenuissimum),木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和短密青霉(Penicillium brevicompactum)。分别隶属于2个亚门、3个纲、4个科和5个属,即葡萄座腔菌属、交链孢霉属、枝孢属、镰刀菌属和青霉属。将分离鉴定得到的疑似病原菌ITS序列上传到NCBI数据库得到基因序列号,与已存在的ITS序列进行比对,得到疑似病原菌亲缘关系与遗传进化树。(2)从新叶叶柄和幼嫩茎段诱导得到感病品种蛇龙珠葡萄(Vitis vinifera L.cv.Cabernet Gernischet)愈伤组织,获得悬浮细胞系。将拟南芥β微管蛋白6融合绿色水母荧光蛋白(GFP-At TUB6)在蛇龙珠葡萄叶片中进行瞬时表达,通过倒置荧光显微镜观察确认其正常表达。利用农杆菌介导法转化葡萄细胞,通过体式荧光显微镜观察到表达绿色荧光蛋白的愈伤组织,利用倒置荧光显微镜观察到围绕在细胞核周围的绿色荧光微管蛋白。(3)利用病原菌葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)和色二孢属真菌(Diplodia seriata)胞外分泌物处理美洲沙地葡萄微管蛋白标记系悬浮细胞,在倒置荧光显微镜下观察葡萄微管蛋白对病原菌胞外分泌物的响应。在3 dpi(days post inoculation),D.seriata处理引起微管蛋白的显著解聚,而B.dothidea处理造成微管蛋白完全降解。为从分子水平观察葡萄细胞微管蛋白对于病原菌胞外分泌物的响应,对D.seriata胞外分泌物处理表达GFP-AtTUB6的V.rupestris细胞进行深度测序分析,将得到的clean reads组装后与参考葡萄基因组进行比对,获得对应的基因表达量。与对照组相比,得到1365个差异表达基因。利用GO与KEGG数据库对差异表达基因进行功能注释,定位到类黄酮生物合成、植物-病原体互作和植物激素信号转导等通路。在差异表达基因中,有53个被定义为转录因子。利用实时定量荧光PCR对转录组结果中的12个基因进行表达量验证,定量结果与转录组结果相符,证明转录组结果可靠。

摘要译文

关键词：

葡萄座腔菌属顶枯病; Diplodia seriata; 葡萄悬浮细胞系; 微管蛋白; 转录组

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

果树学

导师：

关心

中图分类号：

S436.631.1[病害]

学科分类号：

090401[植物病理学];090402[昆虫学]

D O I：

10.27684/d.cnki.gxndx.2020.003216