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发酵麸皮糖蛋白的制备、抗氧化活性评价及分离纯化研究认领

被引量： 11

作者：

杜涓

学位授予单位：

内蒙古农业大学

摘要：

糖蛋白是一种糖类与蛋白质通过共价键结合在一起的生物大分子,广泛分布于动物、植物和某些微生物中,具有增强免疫调节、抑制肿瘤、降低血糖、抗氧化等作用。如今在许多植物中,如大豆、甘薯、山药、裸燕麦等提取出的糖蛋白生物活性已被研究证明。发酵麸皮是通过微生物发酵法所制备的小麦麸皮,菌酶协同发酵可以使小麦麸皮的纤维结构发生变化,从而提高营养物质含量,增强其抗氧化能力。目前对麸皮的研究多集中在多糖,多酚,阿魏酸等活性物质上,国内外对发酵麸皮糖蛋白的研究尚未见报道。因此,从发酵麸皮中提取出糖蛋白,并进一步研究它的性质、功能活性及结构组成有重要的理论和现实意义。本文通过菌酶协同发酵麸皮,采用单因素试验确定了最佳发酵条件,提取分离得到发酵麸皮糖蛋白并对其体内外抗氧化活性进行研究,最后经柱层析法对糖蛋白进一步的纯化,并对纯化后的样品进行结构表征。论文主要包括以下四个部分:1.发酵麸皮糖蛋白的制备本试验采用呼吸袋发酵技术,菌酶协同发酵麸皮,单因素法设置不同的复合菌添加量、纤维素酶添加量、发酵温度、发酵时间、含水量,以蛋白含量和多糖含量为指标,得到最佳发酵工艺参数为:复合菌添加量0.1%,纤维素酶添加量2g,发酵温度28。C,发酵时间3天,含水量40%。通过热水浸提法得到发酵麸皮提取物,醇沉并筛选得出最佳乙醇浓度100%、Sevage法去游离蛋白、透析分离得到发酵麸皮糖蛋白(FWBG)。2.发酵麸皮糖蛋白的验证通过一系列颜色反应检测该糖蛋白含蛋白质和酸性多糖、不含鞣质和淀粉。SDS-PAGE电泳检测表明FWBG为单一条带,且考马斯亮蓝染色和糖染条带位置一致,分子量大致在40 kDa,验证其为糖蛋白。3.发酵麸皮糖蛋白抗氧化活性评价利用DPPH、羟基自由基的清除能力以及其还原力评价FWBG的体外抗氧化活性。结果表明,FWBG有较强的抗氧化能力,且随着浓度的增加,对DPPH、羟基自由基的清除能力以及其还原力越强,呈现一定的量效关系。以斑马鱼胚胎为模型对FWBG进行体内抗氧化活性分析,选取FWBG的实验安全浓度:0.05mg/mL、0.1mg/mL及0.2mg/mL。验证FWBG在AAPH诱导的氧化应激中对斑马鱼胚胎存活率的影响,结果表明通过不同浓度的FWBG(0.05mg/mL,0.1mg/mL,0.2mg/mL)协同处理后,较AAPH组斑马鱼胚胎的存活率显著提高,FWBG可以保护斑马鱼免受AAPH的伤害。采用DCFH-DA、DPPP、AO荧光染料处理后再用荧光显微镜拍照并分析荧光强度发现FWBG在斑马鱼体内还具有清除ROS,降低脂质过氧化以及细胞死亡率的作用,有较好的抗氧化效果且与其浓度有较好的相关性。4.发酵麸皮糖蛋白的分离及结构表征采用DEAE-52纤维素柱纯化FWBG,以上样浓度(5mg/mL、10mg/mL)、洗脱剂(蒸馏水、0.1、0.2mol/LNaCl)及流速(0.5mL/min、1mL/min)为单因素,蛋白质和多糖的吸收峰为检测指标,对最终的洗脱条件进行确定。最终确定上样浓度为10 mg/mL,洗脱剂为蒸馏水和0.1mol/LNaCl,洗脱速度0.5 mL/min,经过DEAE-52纤维素柱洗脱纯化后得到一个主组分FWBG-1。分析FWBG-1的红外图谱、氨基酸组成、单糖组成及扫描电镜。结果显示:在4000-400 cm-1范围内的红外吸收光谱中FWBG-1表现出多个典型的多糖和蛋白质的吸收峰,并且得出FWBG-1糖蛋白糖链是吡喃糖的β-型糖苷键结构;该糖蛋白包含有17种不同类型的氨基酸,其中谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸的含量较高;通过高效液相色谱法测得FWBG-1含有10种单糖,各单糖组成的摩尔百分比为:甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖=4.18:0.57:0.28:0.21:0.07:33.33:4.59:31.29:25.31:0.16,其中葡萄糖含量最高,达到33.33%;在扫描电子显微镜观察FWBG-1的形貌,其表现出凝集比较分散的片状结构,且表观呈现大小不均、表面光滑的圆形球体。

摘要译文

关键词：

发酵麸皮糖蛋白; 提取分离; 斑马鱼; 抗氧化活性; 纯化; 结构表征

学位年度：

2020

学位类型：

硕士

学科专业：

畜牧

导师：

齐景伟

中图分类号：

S816.6[发酵饲料⑨]

学科分类号：

082202[发酵工程];090503[动物营养与饲料科学];090504[智慧养殖与动物生产学]

D O I：

10.27229/d.cnki.gnmnu.2020.000748