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小麦倍半萜合酶TaPS与大麦二萜合酶HvKSL4的功能鉴定认领

作者：

蒲擎宇

学位授予单位：

四川农业大学

摘要：

小麦(Triticum aestivum L.)和大麦(Hordeum vulgare L.)是主要的粮食作物,当它们遭受虫害时,会释放萜类物质趋避害虫或吸引害虫天敌和寄生蜂,包括单萜化合物芳樟醇,倍半萜化合物石竹烯、柠檬烯、佛手柑油烯等,这些挥发性的萜类物质参与到植物的间接防御过程中。另外,萜类化合物还可作为植保素发挥直接防御作用提高植物的抗性。尽管小麦和大麦中已鉴定了部分萜类合酶,但仍然存在大量萜类合酶未被鉴定功能,可能参与到植物的防御反应中。本研究通过筛选已公布的数据并查阅相关文献,对数据库中注释功能的小麦倍半萜合酶TaPS以及大麦二萜合酶HvKSL4进行功能鉴定。首先在大肠杆菌中运用微生物代谢工程技术进行重组表达,并通过GC-MS检测、质谱图比对和NMR分析确定这两个酶的催化功能。同时,根据产物的物理性质及响应胁迫时TaPS的基因表达模式分析,对它在植物间接防御过程中的作用进行了研究,取得以下结果:1.本研究证明TaPS是一个倍半萜合酶。GC-MS检测发现,TaPS能催化trans-FPP生成倍半萜类化合物β-patchoulene(β-广藿香烯),由此,将该萜类合酶命名为TaPS。2.对TaPS基因的表达模式进行分析,发现TaPS在小麦根、茎、叶中均有表达,但是表达量较低。此外,TaPS在各种胁迫下的表达情况显示,丙甲菌素浸泡、禾谷镰刀菌孢子接种以及甜菜夜蛾幼虫侵食都能够显著诱导小麦叶片中TaPS基因的表达,这表明其主要参与到生物胁迫的响应中。3.TaPS产物β-广藿香烯能在小麦叶片中被诱导产生。GC-MS检测到丙甲菌素浸泡后的小麦叶片萃取物中β-广藿香烯被诱导积累,而未受处理的对照组由于生物量少,没有检测到该化合物,结果符合之前的基因表达模式,这也是首次在小麦叶片中发现β-广藿香烯的存在。同时,丙甲菌素在前人的研究中常被用于模拟昆虫取食,所以推测TaPS可能参与到植物抗虫害的防御反应中。4.过表达TaPS的拟南芥株系能够产生β-广藿香烯趋避甜菜夜蛾幼虫侵食。将TaPS基因转入拟南芥中,GC-MS检测的结果显示在转基因拟南芥中有β-广藿香烯存在,而野生型拟南芥中没有。此外,与野生型相比,转基因拟南芥株系OE-TaPS#2和OE-TaPS#5对甜菜夜蛾幼虫具有显著的拒食作用。最后,作者进一步观察统计了β-广藿香烯对甜菜夜蛾幼虫的潜在毒性作用,但并未发现显著的生长抑制效果。5.TaPS催化机理探究。根据同源建模和底物对接的结果,发现在TaPS催化腔中,该基因392位上的氨基酸残基Ile和393位上的Cys与最终产物β-广藿香烯紧密结合,通过与相近的倍半萜合酶比对,将这两个氨基酸分别突变为广藿香醇合酶在等效位置上的氨基酸残基:Cys和Gly,GC-MS检测发现TaPS:I392C和TaPS:C393G催化trans-FPP生成羟基化的倍半萜化合物,表明TaPS中的这两个氨基酸残基参与到中间体的质子化和稳定性以及最后产物的形成,在催化过程中发挥重要作用。6.HvKSL4是一个二萜合酶。将大麦中克隆出的HvKSL4与GGPP合酶以及CPP合酶在大肠杆菌中进行共表达,GC-MS检测发现其催化syn-CPP生成多个二萜,已鉴定出其中三个为syn-stemar-13-ene,syn-stemod-13(17)-ene以及synstemod-12-ene,这三个化合物都是生成二萜植保素的前体物质;另外,HvKSL4还能催化normal CPP生成一个唯一的分子量为272的二萜类化合物,通过对产物分离纯化,用NMR分析其结构,鉴定出该产物为一个新型结构的二萜。结论:小麦中倍半萜合酶TaPS催化β-广藿香烯的形成,该基因在丙甲菌素模拟昆虫取食时被强烈诱导,其产物β-广藿香烯首次在小麦中被鉴定发现,并且转基因拟南芥植株能够释放β-广藿香烯趋避甜菜夜蛾幼虫侵食,表明TaPS参与到植物的间接防御反应中。大麦中的二萜合酶HvKSL4具有功能多样性,能催化不同构型的CPP生成一系列二萜化合物,这些二萜化合物经过下游的氧化修饰生成具有生物活性的二萜植保素,参与到植物的直接防御反应中。上述结果进一步阐明了麦类作物中萜类化合物的生物合成途径,为我们在抗性品种的培育中以直接和间接防御反应相结合的方法防治病虫侵害提供理论基础。

摘要译文

关键词：

麦类作物; 萜类化合物; 胁迫响应; β-广藿香烯; 拒食作用

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

作物遗传育种

导师：

王强

中图分类号：

S512.1[小麦⑨]

学科分类号：

0901[作物学]

D O I：

10.27345/d.cnki.gsnyu.2019.001283