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靶向载黑色素/血卟啉单甲醚PLGA纳米粒光声成像及其声动力治疗研究认领

作者：

黄菊

学位授予单位：

重庆医科大学

摘要：

第一部分纳米粒制备、基本表征及靶向性考察目的制备一种叶酸靶向载黑色素/血卟啉单甲醚的PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded melanin/hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FHMP NPs),考察其基本特性,并观察其对乳腺癌MDA-MB-231细胞的靶向性。方法1.纳米粒的制备及基本表征:采用双乳化法分别制备FHMP NPs、叶酸靶向载血卟啉单甲醚PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FHP NPs)、叶酸靶向载黑色素PLGA纳米粒(folate targeted PLGA loaded hematoporphyrin monomethyl ether nanoparticles,FMP NPs),在光镜、电镜下观察其形态,通过马尔文粒径仪检测其粒径、电位;采用紫外分光光度法检测纳米粒中黑色素(melanin,MNPs)及血卟啉单甲醚(Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)含量,并计算包封率和载药量;将FHMP NPs分散放置于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)一周,每天测量其粒径变化。2.细胞靶向性:将FHMP NPs分别和叶酸(folate,FA)受体阳性表达细胞MDA-MB-231及FA受体阴性表达细胞A-549共孵育1 h、2 h和3 h后,在激光共聚焦显微镜下观察其细胞靶向效果。同时,将靶向FHMP NPs及非靶向HMP NPs分别与MDA-MB-231细胞孵育3 h后,在激光共聚焦显微镜下观察两种纳米粒对细胞的靶向效果。结果1.基本表征:FHMP NPs在光学显微镜下观察呈点状小颗粒,扫描电镜和透射电镜下观察,呈球形,大小均一、形态规则。马尔文粒径仪测得FHMP NPs、FHP NPs及FMP NPs的粒径分别为310.3±10.6 nm,266.1±2.4 nm和270.1±4.9nm,Zeta电位分别为-23.03±1.33 mV,-21.2±0.8 mV和-21.4±1.7 mV。血卟啉单甲醚的包封率为80.13±4.81%,载药量为3.08±6.29%。黑色素包封率为47.72±4.26%,载药量为1.83±3.69%。FHMP NPs分散于PBS和FBS一周后粒径并无明显改变。2.细胞靶向效果:在MAD-MB-231细胞周围可见大量纳米颗粒,而A-549细胞周围没有明显纳米粒聚集。非靶向HMP NPs与MDA-MB-231细胞共孵育3h后仅有少数纳米颗粒聚集于细胞周围。结论本研究成功制备出叶酸靶向纳米粒(FHMP NPs),该纳米粒对MD-MB-231有特异性靶向功能。第二部分纳米粒生物安全性评价及体内分布目的评估FHMP NPs的体内外安全性,并观察FHMP NPs在乳腺癌移植瘤裸鼠的体内靶向分布情况。方法1.生物安全性评价:将不同浓度FHMP NPs(0.25,0.5,0.75,1mg/m L)分别与细胞孵育3 h、6 h、24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;将健康BALB/C小鼠随机分成空白对照组(静脉注射200μL生理盐水)和FHMP NPs组(静脉注射200μLFHMP NPs,10 mg/m L),分别在给药1 h、6 h,24 h,48 h后处死小鼠,收集其血液标本做血常规和血液生化检测。其血常规主要包括:白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、平均红细胞体积(MCV)、血小板(PLT);血生化包括:谷氨酸转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)。2.体内分布:建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,通过尾静脉分别注射Di R标记的FHMP NPs、HMP NPs、游离叶酸+FHMP NPs(叶酸拮抗组),在不同时间点(注射前,0.5 h,2h,4 h,6 h,24 h)观察裸鼠活体荧光分布情况,并采集荧光图像,然后以成像系统软件测量肿瘤区域荧光信号值。24 h后,处死裸鼠,剥取肿瘤瘤块和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾),并进行离体组织荧光成像,比较不同脏器与瘤块的相对荧光信号值。此外,通过尾静脉分别注射Di I标记的FHMP NPs和HMP NPs,24 h后,剥离瘤块做冰冻切片,在显微镜下观察两种纳米粒在肿瘤区域的分布情况。结果1.生物安全性评价:FHMP NPs与MDA-MB-231细胞孵育后,各个浓度各个时间点细胞存活率没有明显降低,各组之间差异没有统计学差异。注射FHMP NPs后的BALB/C小鼠与正常对照组小鼠的血液学检测指标无显著性差异。2.体内分布:荷瘤小鼠活体荧光实验发现,FHMP NPs组纳米粒可靶向分布于肿瘤区域,该组肿瘤部位荧光信号显著高于HMP NPs组和叶酸拮抗组,且其荧光信号值在注射纳米粒2 h后达到峰值。离体荧光成像证实,FHMP NPs主要分布于裸鼠肝脏、脾脏和肿瘤区域。冰冻切片结果显示,FHMP NPs组在注射2h后可在肿瘤区域观测到大量红色荧光纳米粒富集,随着时间的延长,纳米粒富集量越少。而在注射非靶向纳米粒HMP NPs后,在2 h可观测到微量纳米粒分布于肿瘤部位,24 h后无纳米粒分布。结论FHMP NPs具有良好的体内外安全性,并可靶向富集于肿瘤部位。第三部分纳米粒增强光声成像及声动力治疗研究目的观察纳米粒增强光声成像及其声动力治疗效果,并研究其相关作用机制。方法1.体内外光声成像配置不同浓度FHMP NPs纳米粒,以光声成像采集该纳米粒在不同激发波长(680-930 nm)下的光声图像并测量其光声信号值,确定最佳的激发波长。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型并将荷瘤鼠随机分为三组:FHMP NPs、HMP NPs和游离叶酸+FHMP NPs组,经尾静脉注射上述三种纳米粒,采集肿瘤区域不同时间点的光声成像图,定量分析各组光声信号强度值。2.体外声动力治疗2.1超声辐照纳米粒生成ROS检测实验分组:生理盐水对照组(Control组),单独超声组(US),FMP NPs+US组,单独FHMP NPs组,FHMP NPs+US组。超声辐照上述纳米粒后通过DPBF法检测其ROS生成。通过单线态氧探针(singlet oxygen sensor green,SOSG)检测FHMP NPs在超声辐照后不同时间产生的ROS。2.2细胞水平上的ROS检测将MDA-MB-231细胞分为以下组,(1)Control组(空白对照组),(2)US组,(3)FMP NPs+US组,(4)FHMP NPs组,(5)HMP NPs+US组,(6)FHMP NPs+NAC+US组,(7)FHMP NPs+US组。上述各组细胞与2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)孵育后进行超声辐照,通过激光共聚焦显微镜观察活性氧产生情况。2.3靶向纳米粒稳定性检测利用DPBF探针比较FHMP NPs在光声激光仪(PA laser)照射前后ROS产量的变化。实验分组为:Control组、FHMP NPs+PAlaser+US组、FHMP NPs+US。比较不同组之间ROS的产量。2.4 SDT产生细胞毒性检测用CCK-8法分别测定Control组,US组,FMP NPs+US组,FHMP NPs组,HMP NPs+US组,FHMP NPs+US组的细胞存活率。利用钙黄绿素(calcein-AM,CAM)和碘化吡啶(Pyridinium iodide,PI)共染色活死细胞,在激光共聚焦显微镜下观察以上各组的细胞存活状态。3.体内声动力治疗将MDA-MB-231移植瘤裸鼠随机分成以下6组:(1)Control组、(2)US组、(3)FMP NPs+US、(4)FHMP NPs组、(5)HMPNPs+US组、(6)FHMPNPs+US组。每隔3天重复上述治疗,治疗时间段为15天,每天记录裸鼠的体重和肿瘤体积,并拍取BALB/C小鼠数码照片。在治疗结束后,每组处死一只BALB/C小鼠,将肿瘤组织进行病理切片分析。结果1.体内外光声成像:FHMP NPs在700 nm处有最大光声信号值,因此700 nm被用作光声成像的最适激发波长。FHMP NPs的光声信号值强于同等浓度的FHP NPs和FMP NPs。在乳腺癌移植瘤小鼠肿瘤区域可探测FHMP NPs的光声信号,其光声信号值在注射靶向纳米粒2小时后达到峰值,随后随时间逐渐降低。2.纳米粒体外ROS产生及细胞杀伤作用:FHMP NPs联合超声辐照后可产生ROS,而单独超声组或单独FHMP NPs组没有ROS产生,并且光声激光仪辐照后对其ROS的产生没有影响。FHMP NPs随着超声辐照时间的延长,ROS的产量逐渐增多。FHMP NPs与细胞孵育3h后,超声辐照下,细胞大量死亡,在共聚焦显微镜下观察到大量红色死细胞。3.体内声动力治疗:在第一次治疗结束后,各组裸鼠的肿瘤体积没有发生明显的变化,在后期治疗中,FHMP NPs+US组裸鼠肿瘤生长缓慢,而其余对照组肿瘤体积逐渐增加。治疗结束后,FHMP NPs+US组肿瘤部位HE染色结果显示仅残存一点正常细胞,大量细胞形态不可观察,出现核溶解,大量细胞坏死。TUNEL免疫检测显示了治疗组(FHMP NPs+US)的深棕色细胞核增多,说明细胞凋亡严重,而其余对照组却不能观察此现象。PCNA结果显示FHMP NPs+US出现的棕色颗粒最少,表示细胞增殖被明显抑制,而其余对照组没有明显增殖抑制情况。结论FHMP NPs不仅可增强光声成像,在低强度聚焦超声作用下,还可产生大量ROS,通过靶向性SDT作用显著抑制裸鼠乳腺癌移植瘤生长。

摘要译文

关键词：

纳米粒; 表征; 靶向性; 纳米粒; 生物安全性; 体内分布; 纳米粒; 光声成像; ROS; SDT

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

影像医学与核医学

导师：

李攀

中图分类号：

R7336;TB383.1;R943[制剂学]

学科分类号：

083611[医药生物工程];100603[中西医结合药学];100702[药剂学]