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松二糖的酶法制备研究认领

被引量： 4

作者：

赵雅琪

学位授予单位：

江南大学

摘要：

松二糖是一种天然存在于蜂蜜中的还原性二糖,由一分子葡萄糖与一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成,为蔗糖的一种同分异构体,其甜度达到蔗糖的一半。由于松二糖容易结晶、高度可溶、水解速率慢,不易被致龋微生物发酵,适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用,因此具备代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力,在食品工业领域中具有广阔的应用前景。目前仅有两种酶法制备松二糖的报道:其一,嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）来源的环糊精葡萄糖基转移酶（Cyclodextrin glycosyltransferase,CGTase）可利用α-环糊精为最佳糖基供体有效合成松二糖,其产率可达45%,然而α-环糊精价格昂贵并不适用于工业化生产;其二,多糖奈瑟球菌（Neisseria polysaccharea）来源的淀粉蔗糖酶（Amylosucrase,ASase）可直接将蔗糖异构为松二糖,其产率为56%,同时发现另外添加果糖作受体可提高至73%,然而在该反应过程中副产物麦芽寡糖的生成会影响最终的产率,此外,为进一步增加松二糖在食品领域中应用的可能性,还需要选择以食品安全菌株为宿主对酶进行异源表达。由于CGTase具有利用廉价的淀粉衍生物为原料生产高附加值产品的潜力,而淀粉蔗糖酶的转化率较高,因此本文对该两种酶法制备松二糖的工艺均展开研究。一方面,以低成本的玉米淀粉衍生物麦芽糊精代替α-环糊精,对B.stearothermophilus CGTase催化合成松二糖的酶转化条件进行了优化;另一方面,优化合成淀粉蔗糖酶基因npas,对其进行分子改造以减少副产物的生成,同时将野生酶及突变体转化食品安全菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WS11）,进行蛋白纯化及酶学定性,在此基础之上,以野生酶为对照,考察突变体催化制备松二糖的性能,最后优化该重组菌的摇瓶发酵条件及考察其在3-L发酵罐中的高密度培养情况。主要研究结果如下:（1）利用本实验室前期构建的菌株E.coli/pET-20b（+）-cgtopt制备CGTase,为了降低生产成本,以价格低廉的玉米淀粉衍生物麦芽糊精代替α-环糊精作供体,以果糖为受体,考察了不同条件对B.stearothermophilus CGTase合成松二糖的影响。结果表明,当麦芽糊精DE值为16-20时,在50°C、反应初始pH 6.0、加酶量10 U·mL-1的条件下,供体和受体的浓度均为300 g·L-1,反应24 h并经糖化酶糖化后,松二糖的产量可达150 g·L-1。（2）优化合成N.polysaccharea来源的淀粉蔗糖酶基因npas,对其进行分子改造,将+2亚位点处的第396位甘氨酸残基（Gly）突变为丝氨酸残基（Ser）,通过增大空间位阻的方式以减弱聚合活性、减少副产物麦芽寡糖的生成。构建重组质粒pHY300PLK-npas和pHY300PLK-npas G396S,转化食品安全菌株B.subtilis,经TB摇瓶发酵后的酶活分别为0.8 U·mL-1和0.6 U·mL-1,蛋白电泳显示约在66.2 kDa处出现目的条带,并对野生酶与突变体进行了纯化,测定的比活分别为1.11 U·mg-1和0.94 U·mg-1,两者的酶学性质也很接近:最适温度50°C、最适pH 7.0,在30°C下半衰期为40 h,pH在6.0-8.0范围内相对酶活均可维持在90%以上。（3）考察了重组酶NpAS G396S催化制备松二糖的性能,对其酶转化工艺进行优化,结果表明,以684 g·L-1蔗糖为底物,在pH 7.0、反应温度30°C、加酶量0.8 U·mL-1的条件下反应48 h后,松二糖的产量为410 g·L-1,比野生酶NpAS的产量提高了50 g·L-1,此时产率可达60%。此外,探究了添加果糖作受体对合成松二糖的影响,与NpAS相比,NpAS G396S的最优果糖浓度由135 g·L-1减少到90 g·L-1,不仅降低了成本,而且松二糖的产率由73.3%提高至76.75%,此时产量为525 g·L-1。（4）对重组菌B.subtilis/pHY300PLK-npas G396S的摇瓶发酵条件进行了优化,确定培养基的最佳组成为10 g·L-1西王豆粕粉、15 g·L-1西王大豆蛋白胨、5 g·L-1甘油或葡萄糖、1 mM Mg2+、12.54 g·L-1 K2HPO4和2.31 g·L-1 KH2PO4,此时酶活约为1.3 U·mL-1。然后考察了其在3-L罐中高密度发酵的情况,发现当以葡萄糖为碳源时,重组菌所产生的酶蛋白主要集中在胞内,胞外分泌很少,而且随着发酵时间的延长逐渐失活,但若以甘油为碳源,则可有效抑制发酵后期酶活的下降,而且酶蛋白的胞外分泌增多,在33°C、pH 7.0、溶氧30%的条件下,当发酵至80 h时,菌体OD600达到120,此时总酶活约12.5U·mL-1,约是摇瓶发酵的10倍。

摘要译文

关键词：

松二糖; 环糊精葡萄糖基转移酶; 淀粉蔗糖酶; 枯草芽孢杆菌; 酶转化

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

发酵工程

导师：

吴敬

中图分类号：

TS202.3[食品添加剂]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083201[食品科学]