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新西兰牡荆苷Ⅱ促肝癌凋亡与抑制肺癌EMT的机制研究认领

被引量： 2

作者：

罗颖懿

学位授予单位：

广州中医药大学

摘要：

肺癌是目前世界上恶性肿瘤发病率和死亡率最高的癌症,肝癌则是全球死亡率第三高的癌症。诱导癌细胞凋亡是目前抗癌的重要研究方向之一,通过利用药物诱导肿瘤细胞发生程序性死亡,达到逐渐消除肿瘤的目的。恶性肿瘤发生转移是癌症患者死亡的最主要原因,上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)与肿瘤的侵袭与转移密切相关,转化生长因子(Transforming Growth Factor-[β1,TGF-β1)能有效诱导细胞发生EMT。新西兰牡荆苷Ⅱ(ViceninⅡ)是课题组前期从铁皮石斛中提取分离得到的共性特征黄酮碳苷成分,其诱导肿瘤凋亡的研究较少,抗肿瘤转移及EMT的作用机制的研究尚无报道。因此本研究从诱导肝癌HepG2细胞凋亡及抑制TGF-β1诱导的肺癌A549与H1299细胞EMT、迁移和侵袭的分子机制两个方面探讨新西兰牡荆苷Ⅱ的抗肿瘤活性,为新西兰牡荆苷Ⅱ及铁皮石斛黄酮类成分的抗肿瘤活性提供重要的实验基础及补充依据。目的:研究新西兰牡荆苷Ⅱ诱导肝癌HepG2细胞凋亡及抑制TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT、迁移和侵袭的分子机制。方法:1.新西兰牡荆苷Ⅱ诱导人肝癌HepG2细胞凋亡研究(1)MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ对不同肿瘤细胞细胞增殖的影响,筛选出效果最好的细胞模型与合适的给药浓度开展后续凋亡实验;(2)Hoechst33258染色观察HepG2细胞凋亡形态学改变;(3)Annexin V-PI双染法,流式细胞术检测HepG2细胞的凋亡率;(4)实时逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)测定凋亡及MAPK通路相关基因的表达。2.新西兰牡荆苷Ⅱ抑制TGF-p1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT的机制研究(1)MTT法检测新西兰牡荆苷Ⅱ与TGF-β1对肺癌A549及H1299细胞毒作用,筛选出合适的TGF-[β1造模浓度与新西兰牡荆苷Ⅱ给药浓度;(2)倒置显微镜观察新西兰牡荆苷Ⅱ与TGF-β1对肺癌细胞的形态学变化;(3)克隆形成实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞增殖能力影响;(4)划痕实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞迁移能力影响;(5)Transwell小室实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌细胞的侵袭作用;(6)免疫荧光实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ对TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞EMT上皮标志物E-cadherin及间质标志物Vimentin表达的影响;(7)蛋白免疫印迹法(Western boltting)实验检测新西兰牡荆苷Ⅱ及路通抑制剂LY294002和SB431542对TGF-β1诱导的肺癌细胞EMT标志物及PI3K/Akt/mTOR和TGF-β/Smad通路蛋白表达影响;结果:1.新西兰牡荆苷Ⅱ诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡(1)12.5-100μM新西兰牡荆苷Ⅱ处理不同肿瘤细胞后,MTT实验结果显示新西兰牡荆苷Ⅱ对肝癌HepG2细胞增殖抑制里最强,其次是肺腺癌A549细胞、宫颈癌Hela细胞、胃癌SGC7901细胞、结肠癌HT-29细胞、和黑色素瘤B16细胞,故选择细胞模型为肝癌细胞;新西兰牡荆苷Ⅱ具有时间依赖性,48h细胞存活率显著低于于24h,当新西兰牡荆苷Ⅱ浓度小于75μM,HepG2细胞存活率呈浓度依赖性地下降,高于75μM存活率基本不变,故选用给药浓度为75 μM,给药时间为48h开展后续凋亡实验。新西兰牡荆苷Ⅱ的IC 50为50.35μM。(2)倒置显微镜下观察,新西兰牡荆苷Ⅱ组HepG2细胞表现出数量减少,体积缩小,细胞质缩合,膜起泡等调亡特征。用Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察,正常细胞细胞核较大,无颗粒块状荧光,给药组细胞可以观察到细胞核固缩,染色质缩合,核内出现凋亡小体,可见浓染致密的颗粒块状荧光且荧光较强的凋亡典型特征。(3)流式细胞仪测定75μM新西兰牡荆苷Ⅱ作用HepG2细胞48 h后细胞的总凋亡率为14.57±0.91%(p<0.01),与空白对照组相比有显著性差异,表明新西兰牡荆苷Ⅱ能显著促进HepG2细胞凋亡。(4)RT-qPCR检测相关基因的表达量。75μM新西兰牡荆苷Ⅱ作用于HepG2细胞48 h后能显著提高促凋亡基因Bax的表达,降低抗凋亡基因Bcl-2的表达,提高Bax/Bcl-2比值(P<0.01),提高直接参与细胞凋亡caspase 8的mRNA表达(P<0.01),而TNF-α的水平无显著变化;另外MAPK信号通路中关键基因ERK、JNK、P38和NFκB的表达水平显著升高(P<0.01),而ERK、JNK、P38和NFκB表达上调能促进细胞凋亡的发生;表明新西兰牡荆苷Ⅱ可能通过MAPK通路和Bax/Bcl-2、caspase途径诱导HepG2细胞发生凋亡效应。2.新西兰牡荆苷Ⅱ通通过抑制TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路TGF-β1诱导的人肺癌A549及H1299细胞的EMT、迁移与侵袭(1)MTT结果显示小于10 μM的新西兰牡荆苷Ⅱ对肺癌A549及H1299细胞无显著的杀伤作用,当浓度大于10μM,药物浓度及时间依赖性地显著抑制细胞增殖。小于5ng/mL的TGF-β1能促进A549细胞增殖,对H1299细胞无毒作用,当浓度大于5ng/mL,TGF-β1浓度及时间依赖性地显著抑制A549及H1299细胞增殖。故最终选用新西兰牡荆苷Ⅱ的浓度为无细胞毒性的低浓度(2.5、5、10μM),TGF-β1的造模浓度为5 ng/mL进行后续EMT相关实验;(2)倒置显微镜观察5 ng/mL TGF-β1可诱导A549及H1299细胞外形变瘦长,形态变为细长纺锤状,细胞间连接消失,成功地诱导了 EMT的发生,而2.5、5、1OμM新西兰牡荆苷Ⅱ浓度依赖性地使这些EMT的典型特征逐渐消失,从细胞形态学上新西兰牡荆苷Ⅱ能抑制TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞的EMT;(3)克隆形成实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导增加的A549及H1299细胞克隆能力;(4)划痕和Transwell小室实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地抑制TGF-β1诱导增强的肺癌A549及H1299细胞迁移与侵袭能力;(5)免疫荧光实验结果表明10μM新西兰牡荆苷Ⅱ显著增强A549及H1299细胞中TGF-β1诱导减弱的上皮标志物E-cadherin绿色荧光表达,减弱TGF-β1诱导增强的间质标志物Vimentin绿色荧光表达。(6)Western boltting实验结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ浓度依赖性地增强TGF-β1诱导减弱的A549及H1299细胞的上皮标志物蛋白E-cadherin、紧密连接蛋白ZO-1及Claudin-1的蛋白表达量,减弱TGF-β1诱导增强的间质标志物蛋白N-cadherin及vimentin、基质金属蛋白酶蛋白MMP-2、转录因子Snail及Slug的蛋白表达;(7)Westernboltting研究EMT作用机制的结果表明2.5、5、10μM新西兰牡荆苷Ⅱ能浓度依赖性地降低TGF-β1诱导的A549及H1299细胞PI3K/Akt/mTOR通路蛋白p-mTOR、p-Akt、p-p70S6K 以及 TGF-β/Smad 通路蛋白 p-Smad2 和 p-Smad3 的蛋白表达;PI3K/Akt通路抑制剂LY294002组和TGF-β/Smad路通抑制剂SB431542组能显著减少TGF-β1诱导上调的N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和MMP-2的蛋白表达,显著增加TGF-β1诱导下调的E-cadherin和ZO-1的蛋白表达水平,新西兰牡荆苷Ⅱ组与抑制剂组具有相同的效应,进一步证明了新西兰牡荆苷Ⅱ能通过抑制PI3K/Akt/mTOR及TGF-β/Smad信号通路逆转TGF-β1诱导的肺癌A549及H1299细胞的EMT。结论:本研究证明了新西兰牡荆苷Ⅱ可能通过MAPK通路抑制人肝癌HepG2细胞增殖并诱导其凋亡;此外,新西兰牡荆苷Ⅱ还能通过抑制TGF-β/Smad和PI3K/Akt/mTOR信号通路逆转TGF-β1诱导的人肺癌A549及H1299细胞的上皮间质转化、迁移与侵袭。本研究初步证实低浓度的新西兰牡荆苷Ⅱ具有抗肿瘤转移作用,高浓度新西兰牡荆苷Ⅱ具有诱导肿瘤凋亡的作用,为铁皮石斛黄酮类成分及新西兰牡荆苷Ⅱ的抗肿瘤活性提供重要的研究基础与补充依据。

摘要译文

关键词：

铁皮石斛; 新西兰牡荆苷Ⅱ; 肝癌凋亡; 转化生长因子; 肺癌上皮间质转化; TGF-β/Smad 通路; PI3K/Akt/mTOR 通路

学位年度：

2019

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

魏刚

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27044/d.cnki.ggzzu.2019.000876