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基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的金莲花药效物质基础分析及蛇床子素的体内外代谢研究认领

被引量： 13

作者：

廖曼

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

金莲花又名旱荷、陆地莲,是毛茛科植物金莲花（Trollius chinensis Bunge.）和短瓣金莲花（Trollius ledebourii Reichb.）的干燥花,广泛分布于我国北方地区如内蒙古、河北等。金莲花味苦,性寒,无毒,其药用历史悠久,《纲目拾遗》记载其可治口疮、喉肿、浮热牙宣、耳疼、目痛、明目、解岚瘴。民间常用作花茶引用,具有消炎止渴,清喉利咽和清热解毒的功效。中国药典2015年版（一部）收录了5种不同剂型金莲花单方制剂,并规定其含量测定成分为荭草苷。现代药理研究表明,金莲花具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等活性,临床主要用于抗菌消炎,治疗呼吸道炎症、咽炎、扁桃体炎。金莲花中含有的化学成分主要有黄酮类、酚酸类、生物碱类。总黄酮为金莲花的主要有效部位,以荭草苷、牡荆苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷的含量最高,也是其主要药效成分。本研究采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技术首次对金莲花提取物中的化学成分和其主要活性成分荭草苷、牡荆苷在大鼠体内外的代谢产物进行快速鉴定,共鉴定了37个化学成分、12个荭草苷代谢产物和23个牡荆苷代谢产物;此外,首次采用高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱（HPLC-QTRAP-MS/MS）同时测定了金莲花药材中黄酮类和酚酸类11个化学成分含量,可为金莲花药材的质量控制提供科学依据。蛇床子素是一种天然香豆素类化合物,广泛存在于多种药用植物中,例如:蛇床子、前胡和枳实等。据文献报道,蛇床子素具有明显的药理活性,包括抗癌、抗凋亡和神经保护作用。近年来,蛇床子素的杀菌作用也受到国内外的广泛关注,在农业上用作植物源的杀虫剂,具有环保和毒性小的优点。本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合SWATH（Sequential window acquisition of all theoretical fragment-ion spectra）采集技术对蛇床子素在大鼠体内外的代谢产物进行了鉴定,共鉴定了72个代谢产物并总结了蛇床子素的代谢途径,为其在临床和农业应用上的有效性和安全性奠定了基础。第一部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的金莲花化学成分的定性分析目的:建立基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术快速鉴定金莲花中的化学成分。方法:采用Poroshell 120 EC-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.7μm）,以0.1%甲酸水（A）-乙腈溶液（B）为流动相进行梯度洗脱。结果:通过比较化合物的精确相对分子质量数、色谱行为和一级二级质谱碎片,利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS法共推断鉴定了金莲花药材中的37个化学成分,包括17个黄酮苷类化合物,6个黄酮类化合物,3个黄酮醇类化合物,1个二氢黄酮化合物,8个有机酚酸类化合物,1个酰胺类化合物和1个三萜类化合物;其中柳穿鱼叶苷、柚皮素、香叶木素、丹皮酚、阿魏酸、咖啡酸、原儿茶酸和异鼠李素均为首次在金莲花提取物中被鉴定。结论:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法为药用植物金莲花提供了一种快速、高效的定性分析方法,其主要化合物的裂解规律也为金莲花活性物质的代谢研究提供了参考。第二部分HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定金莲花中11个化学成分的含量目的:HPLC-QTRAP-MS/MS法同时测定金莲花药材中荭草苷、牡荆苷、荭草素-2"-O-β-L-半乳糖苷、芹菜素、金丝桃苷、阿魏酸、刺槐素、槲皮素、木犀草素、香草酸和柚皮素的含量。方法:采用Diamonsil C18柱（150 mm×4.6 mm,5μm）,以水（0.1%甲酸）-乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱,体积流量0.8 mL/min,进样量10μL,柱温30oC;采用电喷雾离子源进行负离子模式监测,多反应监测模式（MRM）进行定量分析,源喷射电压为-4500 V,离子源温度为650oC。结果:HPLC-QTRAP-MS/MS法测定金莲花中11个成分的峰面积和质量浓度在测定质量浓度范围内均具有良好的线性关系（r2>0.9987）,加样回收率为98.15%101.6%,精密度RSD值为0.28%1.95%。结论:HPLC-QTRAP-MS/MS法准确、简便、快速、灵敏度高、专属性好,可用于金莲花中11个黄酮类和酚酸类化学成分的含量测定。第三部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的荭草苷与牡荆苷的体内外代谢研究目的:基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,建立一种快速分离并鉴定荭草苷和牡荆苷在大鼠肝微粒体、血浆、胆汁、尿液及粪便样品中代谢产物的方法。方法:采用大鼠肝微粒体作为体外代谢反应模型,将荭草苷和牡荆苷分别与大鼠肝微粒体进行体外Ⅰ相和Ⅱ相温孵试验,分别设置空白组、对照组和样品组,平行孵育三份;大鼠灌胃分别给予荭草苷和牡荆苷,收集给药前后血浆、胆汁、尿液和粪便样品。将处理好的生物样本注入到UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱-质谱联用仪进行数据采集。色谱柱为Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×2.1 mm,2.7μm）配有SecurityGuard?预柱,柱温:40oC,流动相为乙腈:水（含有0.1%甲酸）,梯度洗脱。质谱采用电喷雾离子源（ESI源）,正离子模式监测,采集模式为信息依赖性采集（information dependent acquisition,IDA）。通过与对照品比对,同时借助采集到的液相保留时间、高分辨一级和二级质谱数据,联合MetabolitePilotTM1.5代谢物软件,推测可能的代谢产物结构,并阐述其代谢途径。结果:通过与已有对照品比较保留时间、一级和二级质谱信息,结合荭草苷和牡荆苷质谱裂解规律及MetabolitePilotTM1.5软件中的代谢反应类型,共鉴定了12个荭草苷代谢产物,23个牡荆苷代谢产物。结论:本文归纳总结了荭草苷和牡荆苷在大鼠体内外的代谢反应途径,其主要的代谢反应类型有氧化、甲基化、乙酰化、还原、葡萄糖基团的丢失和葡萄糖醛酸结合反应等。第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术结合SWATH采集方法鉴定蛇床子素的体内外代谢产物目的:采用非信息依赖性SWATH在线数据采集技术,建立快速分离并鉴定蛇床子素在大鼠体内外代谢产物的方法,总结其代谢规律,为进一步阐明药效作用机制提供依据。方法:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS结合SWATH数据采集技术进行全扫描,获取化合物的色谱信息和一级、二级质谱信息,通过MetabolitePilotTM2.0代谢物软件的主成分变量分组（principal component variable grouping,PCVG）功能进行化合物过滤,初步筛选蛇床子素可能的代谢产物;MasterViewTM1.1软件的“关键子离子”（key product ions,KPIs）提取技术作为辅助工具可以快速筛选与母药特征碎片相吻合的、准确度更高的代谢产物。通过比较保留时间和质谱数据,鉴定蛇床子素在大鼠肝微粒体、血浆、胆汁、尿液和粪便中的代谢产物,总结其生物转化途径。结果:通过与已有对照品比较保留时间、一级和二级质谱信息,结合蛇床子素的质谱裂解规律,共鉴定了72个蛇床子素代谢产物,其中在体外大鼠肝微粒体中检测到39个;在大鼠体内血浆中检测到20个,胆汁中32个,尿液中32个和粪便中37个。结论:蛇床子素在肝微粒体和生物体内代谢活性较高,肝脏和粪便中检测到的代谢物数量和种类最多;代谢途径主要为单氧化反应、去甲基反应、脱氢反应、硫酸化、葡萄糖醛酸结合、磷酸化、S-半胱氨酸结合反应和N-乙酰半胱氨酸结合反应。

摘要译文

关键词：

UHPLC-Q-TOF-MS/MS; 金莲花; 蛇床子素; 药物代谢; IDA; SWATH; 肝微粒体

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

药物分析学

导师：

张兰桐

中图分类号：

R285[中药药理学]

学科分类号：

100505[临床中药学];100801[中药资源学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.7666/d.D01514241