Hippo信号通路关键蛋白YAP对白血病细胞生长的调控及分子机制研究-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

Hippo信号通路关键蛋白YAP对白血病细胞生长的调控及分子机制研究认领

作者：

方金勇

学位授予单位：

浙江师范大学

摘要：

成人T细胞白血病(adultT-cell leukemia,ATL)是一种恶性淋巴系增殖性疾病,是由人类T淋巴细胞白血病病毒1型(human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)感染所致。HTLV-1病毒编码一系列调节基因Tax、Rex、p12、p21和HBZ等。Tax,HBZ等病毒蛋白能调控生物体内多条信号通路,如NF-xB,AP-1,TGF-p/Smad等。NF-κB信号通路的激活在病毒致癌过程中扮演非常重要的角色,它能促进ATL细胞的恶性增殖,诱导ATL的发生。然而,HTLV-1激活NF-κB信号通路的分子机制任未完全阐明。Hippo信号通路最初发现于果蝇体内,在哺乳动物中Hippo信号通路主要调控器官发育和再生。此外,该信号通路通过负调节下游效应元件YAP,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。Hippo通路关键蛋白YAP是一种致癌因子,它与肿瘤的恶性增殖,不良预后存在密切关系。研究发现YAP在多种肿瘤中存在高表达。目前ATL细胞中YAP蛋白的功能尚未有研究。因此本课题主要分析了 Hippo通路关键蛋白YAP在调控白血病细胞恶性增殖中的作用,并探究其分子机制。主要研究内容如下:第一部分:YAP在ATL细胞株中存在高表达研究YAP在ATL细胞中的表达情况,我们通过RT-PCR及Western bolt技术检测了 YAP的mRNA水平和蛋白水平。结果显示,相比于对照细胞株(MOTL-4、Hut78、Jurkat),YAP基因在 ATL 细胞株(ATL-T、ATL-2、MT-1、MT-2、MT-4、TL-Oml)中均呈现不同程度的高表达,同样Western bolt结果表明YAP蛋白在ATL细胞株中也存在高表达。第二部分:YAP促进ATL细胞恶性增殖研究YAP是否具有调控ATL细胞恶性增殖的作用,我们首先利用慢病毒介导的RNA干扰技术,沉默ATL-T和ATL-2细胞中YAP基因的表达,并筛选得到YAP沉默稳定株。随后,我们运用MTT实验、平板克隆形成实验和流式细胞术检测YAP沉默后对细胞增殖与凋亡的影响。结果显示,当YAP沉默后,ATL-T及ATL-2细胞的增殖能力显著下降,同时细胞凋亡率明显提高。为了证实上述结果,我们利用了YAP特异性抑制剂Verteporfin。结果显示在YAP抑制剂处理后,ATL-T及ATL-2的增殖能力同样受到明显的抑制。上述结果表明YAP能促进ATL细胞的恶性增殖,抑制细胞凋亡。第三部分:Tax通过NF-κB信号通路从而激活YAP的功能探究HTLV-1对YAP蛋白的调控作用及其分子机制,我们运用双荧光素酶报告基因实验检测ATL细胞中YAP功能的激活情况。结果显示YAP下游效应原件CTGF-Luc报告基因在ATL细胞中出现了显著的激活,表明ATL中YAP的功能被活化。为了进一步证实该结论,我们采用HTLV-1感染性克隆转染对照细胞Jurkat,以及将Jurkat细胞与HTLV-1阳性细胞ATL-T共培养的方法,研究HTLV-1病毒对YAP蛋白功能的影响。结果显示,HTLV-1病毒能显著激活YAP蛋白的功能。随后,我们分析了病毒蛋白Tax,HBZ在其中发挥的作用。报告基因结果显示Tax具有激活YAP功能的作用,而HBZ无明显作用。运用Tax突变体检测发现,缺失对NF-κB激活能力的Tax-M22突变体无法激活YAP的功能。为了证实该结论,我们采用了NF-κB抑制性质粒IκB(S32A/S36A),研究发现当NF-κB被抑制后Tax对YAP功能的激活也随之消失。以上结果表明Tax能激活YAP的功能,并且该激活作用必须依赖NF-κB信号通路。第四部分:NF-κB/p65对YAP功能的激活作用及其分子机制探究NF-κB/p65对YAP功能的调控,我们首先运用双荧光素酶报告基因实验检测NF-κB/p65能否激活YAP的功能。实验结果显示p65能在YAP基础上显著激活YAP下游效应元件8×GTⅡC-Luc活性,表明p65能激活YAP的功能。随后,我们研究NF-κB/p65对YAP功能激活的分子机制。通过免疫共沉淀技术发现p65与YAP蛋白存在结合。进一步研究发现p65能降低YAP-S127位磷酸化水平,并且降低了YAP与其抑制性调节蛋白14-3-3的结合,从而将YAP从细胞质中释放出来。通过荧光观察GFP-YAP的定位以及细胞核、质蛋白的检测,发现p65能促进YAP的入核。上述结果表明NF-κB/p65通过与YAP结合,抑制了YAP的磷酸化以及与14-3-3蛋白的结合,从而促进YAP的入核,最终激活了 YAP的功能。综上所述,本课题发现了Hippo信号通路关键蛋白YAP能促进成人T细胞白血病细胞的生长,并揭示了病毒蛋白Tax及NF-κB/p65激活YAP蛋白功能的分子机制。该研究不仅丰富了成人T细胞白血病发生机制,也为成人T细胞白血病的临床治疗提供一个全新的思路与策略。

摘要译文

关键词：

成人T细胞白血病; Hippo信号通路; YAP蛋白; 细胞增殖; 分子机制

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

赵铁军

中图分类号：

R733.7[白血病⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]