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三种獐牙菜植物化学指纹图谱及质量评价研究认领

作者：

李婕

学位授予单位：

云南中医学院

摘要：

中药市场需求日益增长,组培种苗已实现产业化生产。温度、光照、碳源、氮源、外源激素等理化因子对种苗生长及次生代谢产物合成影响明显,导致中药质量参差不齐。除形态、显微等传统鉴别及整体定性指纹图谱鉴别外,重要药效成分的量化在质量评价中同样意义重大。多指标成分定量指纹图谱兼具指纹图谱整体定性优势和指标性成分定量分析功能,是评价中药质量的有效技术之一。借助模式识别方法处理指纹图谱多维信息库,阐释多成分非线性的复杂体系,实现样本的判别、归类、预测,以期为中药质量评价提供参考。龙胆科獐牙菜属（Swertia）植物主要分布于西南地区,具有清热利胆、退黄、除湿、平肝风、疏肝健胃等功效,在中国、日本、印度、巴基斯坦等亚洲国家已有悠久的药用历史。本论文以青叶胆（S.mileensis）、显脉獐牙菜（S.nervosa）、贵州獐牙菜（S.kouitchensis）的组培材料为研究对象,采用高效液相色谱、紫外-可见光光谱等分析技术,建立三种獐牙菜属药用植物的化学指纹图谱,结合多元统计分析,解析样品图谱化学信息,探讨外源激素浓度、生长阶段、器官发生方式对特征成分含量累积与分布的影响并进行定性鉴别与定量评价研究,为獐牙菜属药用植物的栽培及合理开发利用提供理论依据。论文三部分,第一部分（第一章）建立青叶胆化学指纹图谱,确定特征指标性成分,明确青叶胆及其近缘种之间的相似性;第二部分（第二章至第四章）探讨激素浓度、生长阶段和器官发生方式对特征成分含量积累与分布的影响,并建立三种獐牙菜属植物快速质量评价体系;第三部分（第五章）为文献综述,总结了1966-2016年间报道的30种獐牙菜属植物中419种化学成分,引用参考文献173篇。（1）本章采用超高效液相色谱、紫外-可见光分光光谱结合主成分分析方法对4种龙胆科獐牙菜属植物进行定量分析与定性判别。色谱指纹图谱显示,獐牙菜苦苷（swertiamarin）为所有样品的共有峰且均达到基线分离,确定獐牙菜苦苷为定量评价指标。川东獐牙菜（S.dividii）叶中獐牙菜苦苷含量最高（159.82mg/g）,其次为青叶胆茎（25.91 mg/g）,狭叶獐牙菜（S.angustifolia）中含量最低,叶中甚至低于检测限（6.53μg/mL）。紫外光谱指纹图谱显示,204-290 nm为所有样品的紫外特征吸收区域,240 nm处的强吸收峰表明样品提取液中存在丰富的裂环烯醚萜苷类成分,C=O和苯环的强共轭结构导致270 nm处出现显著吸收,推测样品提取液中含有口山酮类成分。紫外光谱数据经过4点平滑处理除去基线漂移和噪音的干扰,导入SIMCA-P+13.0进行主成分分析。结果显示,种间样品、种内不同器官样品均存在显著差异。此外,基于色谱数据的相似性分析表明,青叶胆与川东獐牙菜相似性最高（>0.92）,与其它两种差异较大（<0.50）。本实验中川东獐牙菜样品采集自低海拔地区（341±5 m）,青叶胆、紫红獐牙菜（S.punicea）和狭叶獐牙菜均采集自高海拔地区（1300-2200 m）,推测海拔是导致4种獐牙菜属植物化学差异明显的原因之一。（2）本章选取6-苄基腺嘌呤（6-BA）、α-萘乙酸（NAA）两种植物生长调节剂,采用超高效液相色谱结合多元统计分析的方法探讨外源激素浓度对青叶胆（n=9）化学成分积累的影响。定量分析结果表明,2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA最利于獐牙菜苦苷积累,含量可达100.11（±0.25）mg/g,激素浓度过高或过低均会产生不利影响。此外,9批组培样品中獐牙菜苦苷含量均显著（p<0.05）高于野生青叶胆样品,说明植物次生代谢产物的高产量可通过组培技术获得。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和系统聚类分析（HCA）结果显示,组培与野生样品之间存在较大差异,主要体现在最初5 min洗脱出来的大极性成分（死时间已扣除）;9批组培样品中除2.0 mg/L6-BA+0.01 mg/L NAA样品被完全区分开,其余8组均未得到较好区分,变量重要性投影（VIP）显示2.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA促进獐牙菜苦苷积累作用显著（p<0.05）。（3）本章选用显脉獐牙菜增殖苗和生根苗作为研究对象,采用超高效液相色谱、紫外-可见光光谱结合偏最小二乘判别分析的方法探讨主要特征性成分的积累与分布。高效液相色谱图显示,獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷、马钱苷酸为所有样品共有峰且均达到基线分离。定量分析结果表明,在增殖阶段和生根阶段,地上部分为4种（裂）环烯醚萜苷类成分的主要积累场所;不同的是,增殖阶段茎中积累量最为丰富（2.19±0.04–7.29±4.82 mg/g）,生根阶段叶中积累量最为丰富（1.00±0.26–19.57±5.34 mg/g）。此外,增殖苗生根之后,獐牙菜苦苷含量剧烈增加（p<0.05）,马钱苷酸、獐牙菜苷、龙胆苦苷含量显著降低（p<0.05）,推测生根启动獐牙菜苦苷生物合成与转运机制。偏最小二乘判别分析、系统聚类分析结果显示,不同器官样品之间差异较大,说明在不同生长阶段,显脉獐牙菜次生代谢产物的积累与分布变化明显。（4）本章以间接和直接器官发生的贵州獐牙菜样品为研究对象,采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）、紫外-可见光光谱、多元化学指纹图谱策略,结合偏最小二乘判别分析探讨特征化学成分的积累与分布。高效液相色谱图显示,龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、芒果苷为所有样品共有峰且均达到基线分离。定量分析结果表明,在间接、直接器官发生的样品中,地上部分为4个特征性成分积累的主要场所,其中獐牙菜苦苷含量最高（30.54±0.2mg/g）,獐牙菜苷最低,在根中甚至低于检测限（0.03 mg/mL）。相比于直接器官发生,间接发生样品中獐牙菜苦苷较高,其它成分含量相似,推测环烯醚萜类成分的生物合成在愈伤组织阶段就已经开始。HPLC（246 nm）+HPLC（258 nm）的融合策略分类效果最为理想,校正均方根误差（RMSEE）和交叉验证均方根误差（RMSECV）分别小于0.07和0.1,正确率为100%。

摘要译文

关键词：

獐牙菜属; 獐牙菜苦苷; 高效液相色谱; 组织培养; 质量评价

学位年度：

2018

学位类型：

硕士

学科专业：

中药学

导师：

黄衡宇王元忠

中图分类号：

R284.1[化学分析与鉴定]

学科分类号：

1005[中医学];100803[中药鉴定学];100804[中药化学];100805[中药分析学]