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TIR区密码子选择对D-氨基酰化酶表达影响的研究认领

作者：

胡礼珍

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

D-缬氨酸,化学名为D-2-氨基-3-甲基丁酸,是合成抗生素、生理活性肽、农药等多种产品的重要原料,广泛应用于医学、生物和农业等研究领域,D-缬氨酸应用带动了其制备技术研究的发展。D-型氨基酸的制备方法主要有两类:一是利用酶或化学不对称合成,二是通过化学法外消旋后进行手性拆分。N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(D-氨基酰化酶,3.5.1.81)催化的手性拆分是目前制备D-型氨基酸的主要途径。不同来源的D-ANase对不同底物的催化效率差别较大,其最适作用底物一般为D-Met、D-Leu及D-Phe的N-酰基衍生物,但是对于手性合成领域中作为重要有机手性源的D-缬氨酸的N-酰基衍生物,部分D-ANase转化效率较低。以D-缬氨酸作为衡量指标,Alcaligenes属来源的D-氨基酰化酶活力最高。将来源于Alcaligenes A-6的D-氨基酰化酶基因用大肠杆菌中的丰沛密码子替换,利用化学和基于PCR技术的酶促方法进行基因全合成,利用pET-32a构建重组表达载体pET-trx-dan,转化进E.coli BL21(DE3)中进行融合表达。经SDS-PAGE、Western-blot和活性测定,D-ANase可在大肠杆菌中进行高效表达。利用CLC Main Workbench 6预测非融合表达载体pET-dan转录mRNA的TIR区二级结构,统计起始密码子ATG下游连续四个氨基酸同义密码子替换后144种序列的ΔG值、ATG区域以及RBS区域形成的双键数量。挑选出ΔG值高、中、低三组序列,每组各6个,构建非融合表达载体并检测外源蛋白的表达和D-ANase活性。ΔG绝对值低组可明显的外源蛋白表达,也能检测到较高的菌体内酶活,为工业化应用奠定良好基础。

摘要译文

关键词：

D-氨基酰化酶; 密码子选择; 核糖体结合区

学位年度：

2017

学位类型：

硕士

学科专业：

生物工程（专业学位）

导师：

高朝辉

中图分类号：

Q78[基因工程(遗传工程）]

学科分类号：

071005[生物化学与分子生物学];071007[遗传学];083601[基因工程]