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草莓灰霉病菌拮抗细菌的筛选、鉴定、活性成分分析及田间防效研究认领

被引量： 9

作者：

王凌宇

学位授予单位：

湖南农业大学

摘要：

草莓在生长的过程中常遭受植物病害的干扰,其中草莓灰霉病是影响草莓产量和品质的重要病害之一。该病是由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的真菌病害,主要侵染黄瓜、西红柿、辣椒、草莓等多种植物,寄主范围广泛。由于该菌选择性强,适应性广、繁殖速度快,容易变异,已发现该菌对多种化学农药产生了抗药性,因此,防治该菌引起的病害具有一定的困难。尤其是生产上长期大量使用化学药剂,如腐霉利、异菌脲、嘧霉胺、乙霉威、多菌灵等,这进一步加重该菌产生抗药性。因此,探寻防治草莓灰霉病的新途径十分必要。采用生物防治技术可避免化学药剂的负面影响,不仅高效、低毒,而且成本低,成为近年来研究的热点。在已开发的生防菌中,有些已经在室内开展了大量的基础研究,有些已经登记注册,但不少生防菌株容易退化,寻找新的菌株迫在眉睫。本研究针对这类问题,从种植草莓的土壤中分离到了对草莓灰霉病菌拮抗效果较强的细菌,并进行相关研究,主要研究结果如下：1)分离筛选了草莓灰霉病菌拮抗细菌采用稀释分离法从土壤中共分离102株细菌,其中菌株W2、W4、W7、W11、 W20对草莓灰霉病菌具有拮抗作用,占所筛选菌的4.9%：菌株W2菌落形态呈放射状,菌株W20菌落形态呈不规则形,而菌株W4,菌株W7、拮抗细菌W11菌落形态呈圆形,菌株W2和拮抗细菌W11菌落表面光滑,而菌株W4和菌株W20菌落表面粗糙。菌株W2和菌株W20菌落边缘不整齐,其他3株菌落边缘整齐。菌株W4菌落呈苍白色,其他3株菌落为乳白色。在筛选的5株拮抗细菌中,拮抗细菌W11对草莓灰霉病菌的拮抗效果最好,其他4株菌拮抗效果较弱。因此,本研究选用拮抗细菌W11作为草莓灰霉病菌拮抗细菌,以备下一步研究。2)鉴定了草莓灰霉病菌拮抗细菌Wll采用平板对峙法评价了拮抗细菌W11对多种植物病原真菌的拮抗作用。结果表明：拮抗细菌W11对草莓灰霉病菌的拮抗效果最好,其次为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani),其他按照拮抗强弱从大到小依次为：辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici),油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae),对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)的效果最弱。说明该菌株的抑菌谱广,可控制多种植物病害,具有进一步开发生物农药的潜力。采用生长速率法研究了拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病菌的毒力,结果发现该菌活性物浓度越高,其抑制效果越明显,当浓度为7.5μg/mL时,抑菌效果最好,达到69.04%；该活性物对草莓灰霉病菌的EC50为4.3363μg/mL,回归方程为y=0.1706+1.9607x,相关系数为0.9622。通过一系列生理生化测定,结果显示该菌株可以使葡萄糖产酸、明胶液化,也能使淀粉水解,MR, V.P、接触酶、硝酸盐还原、甲基红反应试验均表现为阳性,但是吲哚、硫化氢、厌氧生长、丙二酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶试验均表现为阴性。分子生物学鉴定结果显示,该菌株的16S rDNA的序列长度为1477bp,将该序列与NCBI在线数据库中的序列进行比对,发现拮抗细菌W11的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的16S rDNA序列同源性较高,达到100%。建立的系统发育树上亦显示拮抗细菌W11与枯草芽孢杆菌在进化地位上最接近。将16S rDNA的分子生物学鉴定结果与形态学和生理生化试验结果相结合,鉴定拮抗细菌W11为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。3)初步探明了拮抗细菌W11抑菌活性成分采用GC-MS联用仪对拮抗细菌W11活性物进行初步分析,获得总离子流图,并利用峰面积归一法计算了各组分在总组分中的质量分数。按照相似度超过80%,含量超过2%的比例分析物质,共检测到44个化合物,鉴定其中的43个,占总组分的97%。拮抗细菌W11活性成分主要以脂肪类、酮类、酯类、醇类、酸类、酚类、肽类、烯类、胺类、醛类等物质。其中脂肪类物质是拮抗细菌W11活性物的主要成分,占整个活性成分的23.68%；酮类物质次之,其占整个活性成分的18.42；酯类物质居于第3位,占整个活性成分的13.16%；醇类和酸类各占整个活性成分的7.9%；酚类占整个活性成分的5.26%；其余几类物质按照从大到小的顺序依次排列为环类、肽类、醛类、酐类、胺类、嘧啶、吡咯等。4)明确了拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病的田间防效拮抗细菌W11活性物对草莓灰霉病具有一定的防治效果,其中浓度越高,防病效果越好。当浓度为6.25-25μg/mL时,防病效果较差,均低于60%。当浓度为50-70μg/mL时,防病效果介于62-77%。当浓度为100lg/mL时,防病效果最好为81.69%,显著高于对照药剂速克灵的防效。方差分析结果表明：不同浓度处理之间差异显著。另外,拮抗细菌W11活性物对草莓的正常生长无影响,其中草莓叶、花、果、根均未见药害斑点。说明该活性物对草莓的生长安全,可以在生产上大规模推广和应用。

摘要译文

关键词：

拮抗菌; 分离; 鉴定; 成分分析

学位年度：

2016

学位类型：

硕士

学科专业：

农药学

导师：

廖晓兰

中图分类号：

S476[生物防治];S436.68[多年生草本果类病虫害]

学科分类号：

090402[昆虫学];090904[草地保护学];090401[植物病理学]