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干预脑内D-serine水平对Pilocarpine大鼠模型癫痫发作影响的作用与机制研究认领

被引量： 1

作者：

马铁

学位授予单位：

第四军医大学

摘要：

研究背景与目的癫痫是严重危害人类健康的常见病,其终生患病率为7.5‰,严重影响了病人的身心健康。癫痫发作一般可用药物控制,但尚有20%-30%的病人经过抗癫痫药物(AEDs)治疗后,发作仍难控制,成为药物难治性癫痫。随着癫痫手术的开展可以帮助50%难治性癫痫患者控制癫痫,但术后仍需要服用药物。因此探索癫痫的发病机制,寻找新型抗癫痫药物是神经科临床工作亟待解决的问题。D-serine具有类似神经递质的功能,胶质细胞通过突触小泡释放D-serine,通过与NMDA受体结合实现对神经元的调节。D-serine参与神经系统多种疾病如脊髓侧索硬化、精神分裂症、阿尔茨海默病、癫痫等的发生,发展过程。D-serine的代谢主要依靠丝氨酸消旋酶(serine racemase,SR)和D型氨基酸氧化酶(DAAO)。SR具有催化从左旋丝氨酸到右旋丝氨酸的消旋作用,多分布于星型胶质细胞和神经元中。因此SR的分布和数量变化能够在一定程度上反映D-serine作用的部位和功能特点。以往研究已经证实NMDA受体甘氨酸位点拮抗剂具有抗惊厥作用以及在癫痫小鼠脑中D-Serine的合成增多,D-serine的分布与磷酸化的NMDA受体一致。据此,我们提出假设:癫痫发作时可能伴有脑内星型胶质细胞中SR表达增多,星型胶质细胞合成和分泌d-serine增多,d-serine可能通过活化nmda受体参与癫痫发作。本研究的目的是应用pilocarpine大鼠模型,探讨d-serine在癫痫发作中的作用及其相关信号效应机制,为探索新的癫痫治疗靶点提供依据。材料与方法1.免疫组织化学方法:应用幼年、成年大鼠和癫痫患者的海马组织切片,免疫组织化学和激光共聚焦显微镜方法,观察d-serine合成酶sr的组织分布、细胞定位和变化。2.pilocarpine大鼠模型方法:采用技术成熟的锂-匹鲁卡品注射方法,进行大鼠癫痫模型制备。3.药物干预方法:采用大鼠侧脑室埋管、安装海马电极1周后进行注射抑制剂(sr抑制剂;daao抑制剂;生理盐水对照)及腹腔注射nmda受体广谱抑制剂,观察不同处理方法对于癫痫发作的影响。4.癫痫模型的动物行为学与脑电检测:采用racine(1972)标准,进行动物模型的癫痫发作的评分,视频监测脑电变化。5.westernblot定量方法:采用免疫荧光双标方法观察癫痫模型海马内星形胶质细胞和神经元的反应,采用westernblot方法定量分析akt,erk,jnk等信号分子的表达与变化。研究结果1.幼年、成年大鼠和癫痫患者海马内sr的分布、细胞定位与变化特点:sr主要定位于神经元和星形胶质细胞;成年动物海马ca区的sr阳性细胞数量高于幼龄动物,而幼龄海马齿状回的sr阳性胶质细胞数量明显高于成年动物;药物难治性癫痫患者海马组织内sr阳性细胞的数量明显多于脑外伤组。2.干预脑内d-serine合成或降解对pilocarpine大鼠模型的癫痫发作和脑电的影响:本研究比较了pilocarpine、mk-801(nmda受体广谱抑制组)、laaβh(sr抑制剂组)、cbio(daao抑制剂组)。结果表明,与对照组比较,抑制sr的活性能够延长3级发作潜伏期和进入se的潜伏期明显延长;明显减弱脑电总功率。mk801组脑电总功率也明显减弱。3.干预脑内d-serine水平对于pilocarpine大鼠模型海马组织内erk信号分子表达和活性的影响:与对照组比较,抑制sr活性引起海马组织内p-erk的表达明显减少,抑制DAAO活性后P-ERK表达明显增多,表明D-serine水平升高可能是导致EKR信号活化的重要因素。但对于AKT和JNK的变化趋势有待进一步研究确认。初步结论1.D-serine合成酶SR主要定位于大鼠和癫痫患者海马神经元和星形胶质细胞,其数量分布特征显示其与发育或癫痫疾病状态有一定的相关性。2.通过抑制脑内D-serine合成,能够延长大鼠进入3级发作和SE的潜伏期,并减弱在SE时脑电放电总功率。3.海马内D-serine信号可能通过激活ERK信号通路、参与癫痫的发作过程。因此,本研究结果提示脑内D-serine水平的异常变化可能参与癫痫的发作机制,干预D-serine代谢可能会是在癫痫治疗新的靶点。

摘要译文

关键词：

右旋-丝氨酸; NMDA受体; 匹鲁卡品模型; 癫痫; 海马

学位年度：

2015

学位类型：

硕士

学科专业：

神经病学

导师：

陈良为

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]