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新型人工合成钠离子通道阻断剂抑制前列腺癌生长的体内体外研究认领

作者：

孔亚

学位授予单位：

第三军医大学

摘要：

背景和目的:前列腺癌(Prostate cancer)在全球男性中是发病率第二的肿瘤,2012年有1,100,000例新发病例,占男性全部癌症患者的15%。发达国家男性人口占全球男性的17%,但其前列腺癌发病率最高,占全部前列腺癌患者的2/3。虽然亚洲地区前列腺癌发病率较低,但呈现逐年增加的趋势。早期前列腺癌通常没有症状,但发展到晚期常会引起一系列症状,包括排尿困难(尿量减少,排尿次数增多)、血尿、勃起功能障碍等;前列腺癌进一步进展易发生骨转移,癌症转移到骨后会引起臀部、背部、胸部或其他地方的疼痛;当肿瘤压迫脊髓还可能引起腿或足部虚弱麻木、膀胱或者肠失控等。由于前列腺癌的危险因素包括年龄、种族、地理、家族史和基因改变等多不可改变,且具有复杂的分子通路,化疗被认为是治疗前列腺癌的主要治疗方法。因此,找到高效低毒的放化疗药物对于前列腺癌的治疗显得至关重要。电压门控-钠离子通道(Voltage-gated sodium channels,VGSCs)与人类多种恶性肿瘤有关,VGSCs在癌症进程中的各个阶段都发挥着重要的作用,与肿瘤细胞黏附、增殖、迁移、侵袭和转移等相关。研究显示,VGSCs的激动剂能促进癌症细胞的转移,VGSCs的阻断剂能抑制细胞增殖、迁移和侵袭等。VGSCs已经成为癌症治疗的新靶标。因此,重庆医科大学药学院实验室以VGSCs通道蛋白为靶标,运用3D定量构效关系结构模拟软件建立药物结合模型,设计并人工合成了一系列具有VGSCs通道蛋白结合活性的小分子配体-新型钠离子通道胺类配体(Sodium channels amine ligands,SCALs)共15种,分别命名为S0103,S0132,S0135,S0142,S0143,S0152,S0154,S0156,S0158,S0160,S0161,S0163,S0165,S0205,S0307。这一系列小分子配体试图通过与VGSCs的结合,封阻该通道,从而发挥钠离子通道阻断剂的作用抑制前列腺癌转移。本研究以15种SCALs作为筛选化合物,以前列腺癌作为研究对象,评估人工合成的SCALs对前列腺癌生长的影响。VGSCs的通道蛋白Nav1.6和Nav1.7在前列腺癌PC3和LNCa P细胞中大量表达,其m RNA表达水平比正常或增生的前列腺组织高6-27倍(p<0.05),它们可能是潜在的前列腺癌诊断指标和治疗靶点。本研究运用S0154和S0161对PC3细胞进行干预,通过Western blotting实验检测细胞中Nav1.6和Nav1.7蛋白的表达,从而观察SCALs对钠离子通道蛋白的影响。肿瘤细胞发生远处转移是一个复杂的生理过程,需要减少细胞黏附、增加细胞能动性和侵袭能力、蛋白酶解、以及抵抗凋亡等。VGSCs阻断剂多通过抑制肿瘤细胞的侵袭和转移发挥抗肿瘤效应。基质金属蛋白酶类(Matrix metalloproteinases,MMPs)是与癌症转移密切相关的细胞内信号分子,肿瘤细胞分泌MMPs,通过降解细胞基底膜进而迁移和侵袭到其他组织,实现癌症的转移。在一大类MMPs中关于MMP-2和MMP-9的研究较为深入,MMP-2或MMP-9过表达时转移的发生率增加,抑制MMP-2或者MMP-9的表达转移发生率减少。本研究运用S0154和S0161对PC3细胞进行干预,通过检测细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达,从分子水平上观察SCALs对PC3细胞转移能力的影响。同时,我们还运用BALB/c,nu/nu裸鼠建立了PC3细胞移植瘤模型,用S0154或S0161(以DMSO为对照)干预裸鼠移植瘤小鼠,通过监测其体重变化以及移植瘤大小,进而评估S0154和S0161在体内对PC3移植瘤生长的影响。实验方法:1.运用MTT实验初筛15种SCALs对3株前列腺癌细胞(PC3、LNCa P、DU145)生长能力的影响;2.运用钠离子探针实验检测经S0154和S0161处理的PC3细胞内Na+的表达情况,进行Western blotting技术检测干预后PC3细胞中Nav1.6和Nav1.7蛋白的表达;3.运用流式细胞术检测经化合物干预后PC3细胞周期,运用Western blotting技术检测周期相关蛋白的表达情况;4.运用流式细胞术检测经S0154和S0161干预后PC3细胞凋亡情况;5.进行Transwell小室实验,检测S0154和S0161对PC3细胞侵袭能力的影响,Western blotting技术检测MMP-2和MMP-9蛋白的表达;6.采用划痕实验检测S0154和S0161对PC3细胞迁移能力的影响;7.建立PC3前列腺癌移植瘤模型,研究S0154和S0161对裸鼠移植瘤生长情况的影响。实验结果:1.15种人工合成的SCALs中,S0154和S0161抑制前列腺癌细胞株PC3、DU145和LNCa P生长的作用最为显著,IC50值分别在10.51-26.60μM(S0154)、5.07-11.92μM(S0161)之间;2.S0154和S0161增加了PC3细胞内Na+的浓度,抑制PC3细胞中钠离子通道蛋白Nav1.6和/或Nav1.7的表达;3.S0154和S0161通过下调G2/M期的关键蛋白CDK1和Cyclin D1的表达,从而诱导PC3细胞周期阻滞于G2/M期;4.20μM的S0154能促进PC3细胞发生凋亡,但S0161对PC3细胞凋亡作用不明显;5.S0154和S0161下调PC3细胞基质金属蛋白酶类中MMP-2和/或MMP-9蛋白的表达;同时显著抑制PC3细胞的侵袭能力(Transwell小室实验),与对照组相比,2.5μM时即存在显著性差异,10μM的S0154能抑制95%的细胞侵袭,10μM的S0161能完全抑制PC3细胞的侵袭能力;6.划痕实验结果显示,S0154和S0161能抑制PC3细胞的迁移能力,但作用效果不如抑制侵袭明显;7.S0154和S0161能显著抑制PC3移植瘤裸鼠中肿瘤的生长,其中S0161干预2周,实验结束时移植瘤的生长被抑制了50.4%,但其安全性不如S0154。实验结论:在15种SCALs中,S0154和S0161主要通过抑制CDK1和Cyclin D1蛋白表达诱导G2/M期周期阻滞,从而发挥抑制前列腺癌在体内外生长的作用;通过下调MMP-2和/或MMP-9表达抑制肿瘤细胞侵袭进而抑制其转移活性。S0154和S0161可抑制肿瘤细胞生长和侵袭,可抑制前列腺癌移植瘤的生长,是潜在的前列腺癌化疗药。

摘要译文

关键词：

前列腺癌; 电压门控-钠离子通道; 钠离子通道胺类配体; 细胞周期阻滞; 侵袭; 移植瘤模型

学位年度：

2016

学位类型：

硕士

学科专业：

营养与食品卫生学

导师：

许红霞

中图分类号：

R737.25[前列腺肿瘤⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]