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n-3不饱和脂肪酸通过抑制mTORC1缓解DSS诱导的结肠炎认领

作者：

林晓珺

学位授予单位：

南方医科大学

摘要：

一、研究背景与目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括两种类型:克罗恩病(Crohn's disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)。其病因及发病机制尚未明确。IBD的病程迁延反复,不仅影响患者的生活质量,还加重了公共卫生事业的负担,因此,积极探索对IBD的发病机制显得尤为重要,将为IBD防治提供新的策略。研究发现,核苷酸寡聚区域2(nucleotide oligomerization domain 2,NOD2)、细胞因子23(IL23)型辅助T细胞17(Th17)通路都已被证明在IBD的发病机制中起重要的作用。肠道炎症的发生发展中涉及多种炎症因子如白细胞介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等。使用抗生素或其他手段改变肠道菌群均能有效控制IBD的病情。最近研究报道n-3多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)能降低白三烯B4、血栓素A2(thromboxane A2)、IL-1β及肿瘤坏死因子(TNF-α)等强力的促炎因子的生成,从而发挥显著的抗炎作用。在大鼠的DSS诱导肠炎模型中,给予含丰富DHA及EPA的饮食可以有效缓解大鼠肠炎的症状。但n-3PUFAs影响IBD发生的机制目前仍然未阐明。哺乳动物雷帕霉素靶受体(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可整合细胞内外的各种刺激信号,调节蛋白质翻译、脂质合成、细胞生长、增殖、自噬、衰老等多种生命活动。近年来报道其在炎症的发生、发展中扮演重要角色。很大一部分的炎症反应都依赖于抗原特异性T细胞的增殖与克隆,而T细胞的增殖则与mTOR的活性密切相关,通过作为调节性T细胞和效应T细胞相互转化过程的桥梁,mTOR在机体的免疫平衡体系中充当着支点这一角色。而有研究指出,给予雷帕霉素可以抑制mTORC1活性,抑制实验性肠炎的淋巴细胞迁移,从而缓解肠炎的症状。此外,本课题组成员前期的一些研究发现,n-3PUFAs与mTOR的活性有密切的联系。这些结果表明,n-3PUFAs可能通过调节mTORCI的活性影响IBD的发生发展,深入研究n-3PUFAs调控mTOR活性的机制将为IBD防治提供新的思路。我们在预实验中发现,利用DSS诱导C57小鼠发生结肠炎时,同时给予小鼠富含DHA的鱼油灌胃会缓解小鼠肠炎的发展。小鼠的体重下降幅度、结肠炎症短缩的程度及直肠出血的症状都得到了改善。同时,我们利用小鼠结肠组织进行组织切片的免疫组化,发现DSS诱导结肠炎的小鼠肠上皮细胞的mTORC1活性上升,但在DHA灌胃的小鼠中,肠上皮细胞mTORC的活化被抑制。这些结果提示,结肠上皮细胞对结肠炎的发生发展也有重要的影响,而n-3 PUFAs可能通过抑制mTOR信号通路影响结肠炎的发生发展。为证实这一假设,本研究拟通过动物与细胞模型探讨n-3 PUFAs是否通过调节mTORC1活性抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎,以及寻找mTOR影响IBD发生发展的机制,为使用n-3 PUFAs、靶向mTORC1信号防治IBD提供实验依据。二、研究方法1、转基因小鼠和基因敲除小鼠与结肠炎小鼠模型构建。将fat-1小鼠与C57小鼠交配繁殖出fat-1阳性小鼠,同窝的fa加-1阴性小鼠作为对照;此外运用Cre-loxP系统繁殖CAC;Tsc1-/-小鼠,同窝Tsc1-/-小鼠作为对照;将fat-1小鼠与CAC;,Tsc1-/-小鼠交配繁殖出fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠,同窝CAC;Tsc1-/-小鼠作为对照。然后进行利用DSS诱导小鼠发生结肠炎。2、通过检测小鼠造模期间的体重变化及隐血试验结果的变化,来计算疾病活动评分。造模结束后,取小鼠结肠进行长度测量及组织切片。运用HE染色观察结肠组织结构的改变并根据预先设定的评分标准进行病理评分。综合上述的几个指标,对小鼠结肠炎的病变程度进行分析与判定。3、利用组织切片免疫组化及免疫荧光来了解小鼠结肠上皮pS6的表达,用以判定mTORC1的活化程度。除此以外,我们利用EDTA法提取了小鼠结肠上皮细胞,通过免疫印迹来确定与mTORC1活性相关的蛋白的表达水平;同时利用Trizol试剂提取结肠上皮细胞的组织mRNA来进行IL-1β及IL-6等因子的转录水平测定,了解小鼠的炎症相关因子的转录水平改变。三、研究结果1、n-3PUFAs可以缓解DSS诱导的C57小鼠的结肠炎。造模后,(1)对照组造模周期的后两天的体重较实验组明显下降,经统计差异显著(p<0.05)。n-3PUFAs的摄入能够对肠炎造成的体重下降起一定的保护作用。(2)实验组小鼠结肠的实际长度较对照组长;(3)实验组小鼠的体重肠长比也较对照组更接近正常小鼠。(4)在造模周期的后两天,实验组的直肠出血评分显著低于对照组(p<0.05)。(5)实验组的疾病活动评分(DAI)也比对照组低(p<0.05)。(6)实验组的结肠组织切片病理评分较对照组低,差异有统计学意义(p<0.05)。2、转入fat-1基因能缓解DSS诱导的小鼠结肠炎。我们利用转入了fat-1基因的小鼠进行DSS肠炎诱导,发现(1)fat-1小鼠能够缓解肠炎引起的体重下降,特别是造模周期的后两天,与对照组对比有统计学差异(p<0.05)。(2)fat-1小鼠的结肠长度也比对照组要长。fat-1小鼠的体重肠长比较对照组更接近正常小鼠。(3)fat-1小鼠的结肠组织切片的病理评分也显著低于对照组(p<0.05),结肠损伤更少。3、摄入外源及内源产生的n-3 PUFAs均能下调DSS诱导的肠炎模型结肠上皮细胞的mTORC1活性。我们利用小鼠结肠的组织切片免疫组化检测mTORC1活性即pS6(s235/236)表达水平。结果显示:DSS诱导肠炎模型中,小鼠结肠上皮细胞的pS6(s235/236)表达增加,mTORC1活性提高。而外源摄入(C57小鼠以DHA灌胃)及内源产生n-3PUFAs(fat-1小鼠)在DSS诱导肠炎时结肠上皮细胞的mTORC1活性被抑制。此外,我们还提取了小鼠的结肠上皮细胞进行western blotting,结果显示pS6(s235/236)在肠炎发生时表达上升,在给予了DHA灌胃的小鼠和fat-1小鼠中表达基本恢复到正常水平。4、小鼠结肠上皮特异性敲除TSC1能加重DSS诱导的结肠炎。通过应用Cre-loxp系统我们获得了结肠上皮细胞特异性敲除Tsc1的小鼠,CAC;Tsc1-/-小鼠。对这种小鼠及其同窝对照进行DSS诱导肠炎后,我们发现,(1)CAC,Tsc1-/-小鼠因肠炎引起的体重下降较对照组更重(p<0.05)。(2)CAC;sc1-/-小鼠的结肠较对照组短。(3)疾病活动评分显示CAC;Tsc1-/-小鼠的疾病活动程度较高(p<0.05)。(4)CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠组织病理切片的病理评分较对照组要高(p<0.05)。(5)利用肠上皮细胞的组织RNA进行荧光定量PCR显示促炎因子IL-1β和IL-6的转录水平都比对照组明显上升(p<0.05)。5、fat-1缓解DSS诱导的结肠上皮特异性敲除TSC1的小鼠的肠炎。在CAC,Tsc1-/-小鼠中再转入fat-1基因而繁殖出fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠后,我们同样进行了 DSS诱导肠炎模型。结果显示,(1)肠炎造模中fat1-CAC;Tsc1-/-如小鼠的体重下降幅度比对照的CAC;Tsc1-/-小鼠小(p<0.05);(2)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠长度较对照组长。(3)fa11-CAC;Tsc1-/-小鼠的体重肠长比也较CAC;Tsc1-/-小鼠有显著改善(p<0.05)。(4)DAI评分也显示fat-1的加入能缓解CAC;Ts,Tsc-/-小鼠的肠炎进展。(5)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的结肠组织切片的病理评分也较对照低。(6)利用RT-PCR进行检测则发现fat1-CAC;Tsc-/-小鼠结肠上皮细胞的IL-1 β及IL-6的mRNA转录水平下调。6、CA4C;Tsc1-/-小鼠的结肠上皮细胞在肠炎时Fpr2表达上调,而fat-1转基因可以抑制mTORC1活性同时下调Fpr2表达。通过对小鼠结肠组织切片进行免疫组化我们发现,(1)fat1-CAC;Tsc1-/-小鼠的肠上皮细胞的pS6(s235/236)表达较对照组下调,mTORC1活性下降。(2)利用结肠上皮细胞蛋白进行westernblotting也显示pS6(s235/236)表达下调,mTORC1活性下降。我们同时还检测了结肠上皮细胞Fpr2的mRNA转录水平。结果显示(3)CACTsc1-/-小鼠结肠上皮细胞Fpr2的转录水平上升;(4)fat1-CAC;T,Tsc1-/-小鼠结肠上皮细胞的Fpr2转录水平下降。四、结论1、外源摄入和内源产生的n-3 PUFAs都能缓解DSS诱导的结肠炎并抑制小鼠肠上皮mTORC1活性。2、结肠上皮特异敲除Tsc1引起mTORC1活化,会加重DSS诱导的肠炎。3、内源产生的n-3 PUFAs(fat-1)能够缓解结肠上皮细胞mTORC1活化所致的小鼠肠炎进展,同时抑制结肠上皮细胞mTORC1活性。4、n-3 PUFAs可能通过抑制肠上皮细胞mTORC1活性、下调Fpr2转录水平从而缓解DSS诱导的肠炎。

摘要译文

关键词：

炎症性肠病; 溃疡性结肠炎; 葡聚糖硫酸钠; mTORC1; n-3多不饱和脂肪酸; fat-1; 甲酰肽受体2

学位年度：

2015

学位类型：

硕士

学科专业：

细胞生物学

导师：

白晓春

中图分类号：

R574.62[结肠疾病⑨]

学科分类号：

100201[内科学]