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蛋清源ACE抑制肽的结构与完整吸收关系研究认领

被引量： 16

作者：

丁龙

学位授予单位：

吉林大学

摘要：

肽的完整吸收是指某些肽可以不被水解，通过一定方式直接透过小肠进入体内，以完整的形式被机体所吸收。目前二肽与三肽的完整吸收已经为人们所接受，但是氨基酸残基数大于3的肽的完整吸收性还没有得到广泛的认同，这也成为了食源性肽，特别是食源性功能肽研究中一个亟待解决的问题，因为目前相当一部分依据体外活性评价方法所鉴定出的功能肽段的氨基酸残基数都要大于3，这些肽的完整吸收是发挥人们所预期的功能的前提，如果不能证明这部分肽的完整吸收，那么对食源性功能肽的更深层次研究将缺乏实际应用的理论依据。本文主要研究基于Caco-2（the human colon adenocarcinoma cell lines）细胞模型的蛋清源ACE抑制肽的完整吸收性以及ACE（Angiotensin convertingenzyme）抑制肽的结构与其完整吸收之间的关系。通过建立Caco-2细胞膜模型，测定蛋清源ACE抑制肽基于Caco-2细胞膜的表观渗透系数Papp （apparentpermeability coefficient），评价蛋清源ACE抑制肽的完整吸收性及其完整吸收途径，并通过结构改造方法制备一系列肽序列，进行蛋清源ACE抑制肽的结构与完整吸收之间关系的研究。全文研究内容主要分为以下三个部分： 1. Caco-2细胞膜模型的构建及完整性评价。将Caco-2细胞以1×105细胞/孔的密度接种到12孔transwell培养小室半透膜上，连续培养21～23天，分别通过测定细胞膜跨膜电阻TEER（transepithelial electrical resistance）、细胞膜两侧碱性磷酸酶活力及共聚焦激光扫描显微镜观察细胞膜分布形态三种方法评价Caco-2细胞膜的完整性。结果表明，Caco-2细胞膜的跨膜电阻值TEER在第19天至23天开始出现稳定，基本维持在400cm2左右，说明细胞紧密连接程度较好，形成了致密的细胞层结构；碱性磷酸酶测定结果显示，在第21天，AP（apicalside）侧碱性磷酸酶活力是BL（basolateral side）侧的13.66倍，表现出较大的细胞极性，说明Caco-2细胞膜已经出现了明显的极性分化，形成了具有明显极性的膜结构；FITC-phalloidin和DAPI双染色共聚焦激光扫描显微实验结果显示，Caco-2细胞分布均匀且紧密连接，整个Caco-2细胞膜的完整性较好。因此，本实验中构建的Caco-2细胞膜完整性良好，能够用来体外模拟小肠上皮细胞层，进行蛋清源ACE抑制肽的完整吸收研究。 2.蛋清源ACE抑制肽的完整吸收研究，由于ACE抑制肽对胃肠道尤其是小肠上皮刷状缘膜酶的稳定性的不同，将ACE抑制肽分为两类，即对刷状缘膜酶稳定的ACE抑制肽和对刷状缘膜酶敏感的ACE抑制肽，因此，分别选取一条ACE抑制肽QIGLF（IC50:75μM）和RVPSL（IC50:20μM）研究其完整吸收性及完整吸收途径：（1）对胃肠道消化酶稳定的蛋清源ACE抑制肽QIGLF的完整吸收研究：结果表明，QIGLF与Caco-2细胞膜共培养2h后，QIGLF的稳定性>96%；QIGLF对Caco-2细胞膜的完整吸收率随着吸收时间和初始肽浓度的增加而增加，吸收动力学参数Km为32.37±12.59mM，Vmax为1.23±0.49uM/min cm2，当QIGLF初始浓度为1mM，吸收时间为2h时，具有最大吸收速率，表观渗透系数Papp为(9.11±0.19)×10-7cm/s；吸收机制研究结果显示，细胞旁路渗透可能是QIGLF完整吸收的最主要途径。（2）对胃肠道消化酶敏感的蛋清源ACE抑制肽RVPSL的完整吸收研究：结果表明：RVPSL与Caco-2细胞膜共培养2h后，约有36.31%的RVPSL可能被Caco-2细胞膜上分布的膜肽酶所降解，而膜肽酶DPPIV（dipeptidyl peptidaseIV）的抑制剂diprotin A可以将膜肽酶对RVPSL的降解率降低至23.49%；RVPSL对Caco-2细胞膜的双向吸收转运实验结果显示，吸收渗透系数Papp (AP-BL)为(6.97±1.11)×10-6cm/s，外排渗透系数Papp (BL-AP)为(2.52±0.08)×10-6cm/s，说明RVPSL对Caco-2细胞膜的吸收显著大于其外排，但使用了diprotin A之后，Papp(BL-AP)增大到(6.53±0.08)×10-6cm/s，与其吸收渗透系数Papp (AP-BL)(7.29±0.81)×10-6cm/s相比，并无显著性差异，说明RVPSL对Caco-2细胞膜的吸收转运是被动的和非极性的；吸收机制研究结果显示，细胞旁路渗透可能是RVPSL完整吸收的最主要途径。 3.蛋清源ACE抑制肽的结构与完整吸收关系研究。通过对蛋清源ACE抑制肽RVPSL进行结构改造得到一系列肽序列，并进行完整吸收实验，结果表明：Pro替换RVPSL的C端氨基酸残基后其表观渗透系数Papp的变化无明显规律，但Pro替换RVPSL的N端氨基酸残基后表观渗透系数Papp的变化呈一定规律分布，Papp值的大小顺序为PPP-X-X> RPP-X-X> PVP-X-X> RVP-X-X （X代表Pro、Leu或者Ser），说明N端Pro残基比Val残基和Arg残基都更有利于肽的完整吸收；四肽RVPS的Papp值大于先导序列五肽RVPSL，但是VPSL的Papp值却显著小于RVPSL甚至本实验中所有的肽；二肽RV和SL、三肽RVP和PSL的Papp值均大于先导序列五肽RVPSL，且二肽的Papp值大于三肽，二肽和三肽的高Papp值可能是由于其完整吸收途径与四肽和五肽不同，四肽和五肽可能主要由细胞旁路途径被完整吸收，而二肽和三肽则可能主要以载体介导的主动转运形式被完整吸收，且载体介导的主动转运比细胞旁路渗透具有更高的吸收转运效率。

摘要译文

关键词：

蛋清; ACE抑制肽; 完整吸收; 构效关系; Caco-2细胞膜

学位年度：

2015

学位类型：

硕士

学科专业：

食品科学

导师：

刘静波

中图分类号：

TS201.2[食品化学]

学科分类号：

0822[轻工技术与工程];083201[食品科学]