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革兰氏阴性菌群体感应抑制剂的筛选与活性评价认领

被引量： 20

作者：

周丽曼

学位授予单位：

中国海洋大学

摘要：

细菌群体感应（Quorum sensing，QS）是指细菌之间通过产生、释放并感知信号分子，从而进行细菌信息交流的现象。细菌群体感应参与调控了很多病原体中关键致病的毒力因子。与传统抗生素药物相比，细菌群体感应抑制剂（Quorum sensinginhibitors，QSIs）可以在不影响细菌生长的情况下，抑制细菌的群体感应机制并降低细菌的毒力。以细菌群体感应为靶标干扰感染宿主的病原体，可以解决微生物的耐药性问题，并降低病原体的致病力。本文的研究目的是从海洋微生物次级代谢产物与中药材提取物中筛选、追踪分离具有抗革兰氏阴性菌群体感应活性的化合物，并对其进行活性评价。从海洋微生物次级代谢产物与中药提取物中分离获得的群体感应抑制剂，有潜力成为新型抗细菌感染的药物。从青岛黄岛区分离纯化得到海洋真菌、放线菌、酵母菌共130余株，并筛选获得一株海洋真菌Penicillium sp. QF046粗提物具有抗紫色杆菌（Chromobacteriumviolaceum）群体感应系统抑制活性。对Penicillium sp. QF046进行发酵培养，在其发酵培养液中分离得到活性单体化合物LM05，利用核磁（1H NMR，13C NMR）等方法鉴定了LM05结构，本研究首次证明该化合物具有抑制紫色杆菌群体感应系统的活性。化合物LM05在不影响细菌生长的浓度范围内，能明显地降低紫色杆菌紫色菌素产量，RT-PCR技术证明其能够显著降低QS相关的基因表达水平。中药是我国珍贵的医药化合物资源宝库，从中药中提取的化合物毒性较低、生物活性多样。使用铜绿假单胞菌las系统筛选模型与紫色杆菌QS指示菌株，筛选了70余种中国传统药材，结果表明，丁香提取物具有较好的抗铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的las群体感应系统活性和抗紫色杆菌QS活性。本研究通过生物活性自显影的TLC技术、制备TLC技术与HPLC分析技术首次证明，丁香中含量最高的丁香酚具有抗细菌群体感应系统活性。丁香酚在亚抑菌浓度下，可以显著抑制细菌毒力因子的产生，包括铜绿假单胞菌弹性蛋白酶、生物被膜的产生及紫色杆菌紫色菌素的产量。对绿脓菌素产量的抑制最为强烈，丁香酚浓度在50μM下，对绿脓菌素产量的抑制就可以达到56.1%。为了排除铜绿假单胞菌中其他群体感应系统的干扰，利用大肠杆菌群体感应报告菌株MG4/pKDT17与pEAL08-2检测丁香酚对于las和pqs群体感应系统的抑制。这两株菌报告基因——β-半乳糖苷酶基因前分别连接lasB与pqsA启动子，且分别表达LasR蛋白与PqsR受体蛋白。实验结果证明丁香酚可以抑制异源表达的las与pqs群体感应系统。丁香酚具有抗细菌群体感应系统活性，这是植物单酚类化合物又一新发现的生物活性。通过比较丁香酚及其结构类似物乙酸丁香酚酯、丁香酚甲醚的抗细菌群体感应活性发现，丁香酚酚羟基取代的化合物抗细菌群体感应的活性明显弱于丁香酚，乙酸丁香酚酯对弹性蛋白酶、绿脓菌素等毒力因子的抑制也明显弱于丁香酚。因此，丁香酚的酚羟基对其抗细菌群体感应活性至关重要。这一结论对于研究植物单酚类化合物抗细菌群体感应活性有一定的指导意义。与传统抗生素的作用机制不同，细菌群体感应抑制剂可以抑制细菌QS调控的毒力因子的产生，但不会使细菌生长产生选择性压力，理论上能够降低细菌耐药性产生。因此，本研究是一项具有重要的理论意义和明确的应用前景的研究课题。以干扰细菌群体感应为靶标开发新型药物，为解决细菌耐药性问题提供了一个新的思路，也为生物活性物质的开发研究引入了新的理念和方法。

摘要译文

关键词：

群体感应抑制剂; 毒力因子; 筛选系统; 海洋真菌; 丁香酚

学位年度：

2013

学位类型：

硕士

学科专业：

生药学

导师：

于文功

中图分类号：

S917.1[水产微生物学]

学科分类号：

0908[水产]

D O I：

10.7666/d.D326902