海洋生境分泌α-淀粉酶抑制剂微生物的筛选及活性成分纯化的研究-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

海洋生境分泌α-淀粉酶抑制剂微生物的筛选及活性成分纯化的研究认领

被引量： 10

作者：

苏照环

学位授予单位：

广西师范大学

摘要：

α-淀粉酶抑制剂(Alpha-amylase inhibitors)在临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高血脂、肥胖等病症；在农业上,α-淀粉酶抑制剂基因可作为抗虫基因,改良植物抗虫性,减少杀虫剂的使用；在酶学研究方面,可作为探究α-淀粉酶活性部位的分析工具,作为通过选择作用测定α-淀粉酶同工酶的反应物,作为蛋白质与蛋白质之间识别和相互作用的模林体系等。本课题对广西红树林自然保护区海水、海泥中的微生物以及红树林植物红海榄内生真菌进行α-淀粉酶抑制活性菌株筛选分离,根据菌株的形态与培养特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析,确定该菌的归属。探究优化该菌最佳的培养和发酵条件,对其产生的α-淀粉酶抑制剂进行纯化方法研究,并对该物质的理化性质进行研究。本论文研究的方法和主要结果如下： 1、菌株的分离筛选采用常规稀释涂布分离法、内生真菌平板分离法,从海水、海泥以及红树植物中分离出36个菌株,对其发酵液分别采用a-淀粉酶抑制剂筛选模型的打洞法初筛和Bernfeld法进行复筛。海水、海泥共筛选到12株菌,内生真菌筛选到2株菌通过初筛模型,均对α-淀粉酶有一定的抑制效果,其中海泥菌株NTS-11的发酵液对α-淀粉酶的抑制活性最高,透明圈仅为2.18cm(对照组为2.80cm)。选取初筛的14株菌采用Bernfeld法进行复筛,并以阿卡波糖作阳性对照实验,结果显示,海泥菌株NTS-11的发酵液对α-淀粉酶有较强的抑制效果,1ml的发酵液原液与0.02mg的阿卡波糖抑制效果相当,对α-淀粉酶、唾液淀粉酶的抑制率分别为34.23%、29.36%,抑制酶活为266.1935U·100ml-1。 2、菌种鉴定选取对α-淀粉酶抑制活性最高的菌株NTS-11,在Zobell-2216E培养基上进行划线培养,32℃培养2-7d后,菌落呈圆形,质地黏稠状,不透明,表面光滑且显淡黄色,中央隆起,边缘整齐,菌落与培养基结合疏松,易挑取；显微镜下显示,菌体粗长杆状,有厚荚膜；偶见芽孢,通过芽孢染色观察,芽孢呈两种形态,椭圆形或长杆状端生,菌体和芽孢的大小多在2-41μm范围内。将菌株NTS-11接种于多种培养基上进行培养特征鉴定。结果该菌株在普通细菌培养基一LB培养基上生长速度较快,且能较好利用海洋细菌专用培养基,同时对部分常见单糖和二糖碳源能较好的利用,尤其在以D-麦芽糖和D-葡萄糖为碳源的培养基中,菌株生长速度较快,2d时菌落直径可达5mm左右。菌株在发酵过程中,利用葡萄糖发酵产酸,pH值不断降低,使甲基红试验呈阳性,有明胶液化能力,能分解含硫的氨基酸产生硫化氢,并在培养液表面形成少量的菌膜。该菌的某些生理生化特征与大肠杆菌等细菌一致。提取菌株NTS-11的基因组DNA,采用细菌的通用引物对其进行16S rDNA基因PCR扩增,由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带,用UNIQ-10DNA胶回收试剂盒进行纯化并外送进行序列测定。16SrDNA序列测定结果显示,该序列长度为800bp。将序列通过BLASTN与GenBank文库中已有的序列进行比对,并用MEGA4.0软件构建Neighbour-Join系统发育树可知,该菌株与Pontibacillus属的两个模式种BH030004和BH030062有97%的同源性；结合形态、培养、生理生化及碳源利用试验与两个模式种BH030004和BH030062的各项试验指标比对,可认为NTS-11为芽孢杆菌科Pontibacillus属中度嗜盐菌的一个未定种,暂命名为Pontibacillus marine sp. NTS-11。 3、菌株稳定性实验及其发酵条件的研究菌株Pontibacillus marine sp. NTS-11进行传代实验表明,该菌株经6代的传代培养稳定性较好,能利用的最佳碳源、氮源分别为麦芽糖和酵母膏；在发酵时间、培养温度、培养初始pH值、装瓶量这四个发酵培养条件中,发酵时间对菌株产α-淀粉酶抑制剂影响最大,其他由大到小依次是装瓶量、培养温度和初始pH值。各因素的最优水平为：时间144h,温度36℃,pH=9,装瓶量50ml。最优水平组合A2B2C3D1的发酵液表现出最高的对α-淀粉酶的抑制率,达到57.34%,同时该组合对唾液淀粉酶亦产生很好的抑制作用,抑制率为46.35%。对正交表数据进行方差分析,结果发酵时间和装瓶量对抑制率的影响达到显著水平。说明主要是发酵时间和装瓶量对发酵结果的影响起到最重要的作用。 4、α-淀粉酶抑制剂有效部位的筛选取最佳发酵条件发酵的发酵液1L进行预处理,用液-液萃取法按极性由小到大的有机溶剂顺序进行萃取,回收几种有机相和最后剩余的水相进行浓缩,最后得到石油醚相、三氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相各5m1。将萃取得到的浓缩液分别用打洞法及Bernfeld法与阿卡波糖阳性对照一起进行降糖活性的测定,得到抑制活性最高的水相,对α-淀粉酶的抑制率达到71.42%。 5、α-淀粉酶抑制剂的纯化取对α-淀粉酶抑制率最高的水相进行降糖活性成分的分离纯化。采用D-101型大孔吸附树脂进行脱脂除盐,洗脱剂为甲醇-水系统,洗脱剂比例为0：10、2：10、5：10、10：0,每个比例洗脱3个柱体积,将洗脱液浓缩后采用Bernfeld法进行降糖活性测定,结果显示洗脱剂甲醇-水的比例为2：10的流分对a-淀粉酶的抑制率最高,达到66.32%。将大孔吸附树脂粗分的样品用湿法上200-300目硅胶层析柱,洗脱溶剂系统为氯仿-甲醇系统,按极性从小到大梯度洗脱,比例依次为：20：1、15：1、10：1、6：1、4：1、2：1、1：1、1：3、1：5、0：10。每个梯度洗脱2个柱体积,洗脱液浓缩成等体积浸膏后分别进行a-淀粉酶抑制活性检测,结果在洗脱液氯仿：甲醇比例为2：1时,具有抑制活性的物质被洗脱出来,经浓缩后该流分对α-淀粉酶抑制率达到82.46%。选取甲醇-水系统作为Sephadex LH-20柱层析洗脱剂继续分离降糖活性成分,洗脱剂比例为1：5,洗脱速度为1ml-min-1,每管接5m1,共接得30管流分,约3个柱体积(150ml), TLC法分别合并相同组分,Bemfeld法分别测定降糖活性。结果显示在50-80min时间内(即第10管～第16管),大量的目的产物被洗脱下来,对α-淀粉酶抑制率达92.72%,同时对唾液淀粉酶抑制率达79.54%。将纯化的样品用2m1甲醇溶解,采用HPLC进行分析,HPLC分析条件为：Waters515高效液相色谱仪, Waters2487双通道紫外检测器,Sun FireTM C18柱(4.6×250mm),进样量：5μl,柱温：室温,流速：1.0ml-min-1,检测波长254nm。结果在12.19min时出现一单峰,在1min左右时间内大量物质被洗脱下来,接取该组分,通过Bernfeld法检验,结果显示该物质对α-淀粉酶的抑制率为87.43%,抑制α-淀粉酶酶活为777.6614×87.43%=679.91U·100m1-1,是所筛选的α-淀粉酶抑制剂。该纯化物抑制α-淀粉酶的最适反应条件为：温度50℃、pH值7.0。最大抑制酶活为777.6614×94.51%=734.9678U·100m1-1,相当于1.202mg·ml-1阿卡波糖的抑制效果。通过化学成分预实验,初步显示该物质为糖苷类物质。

摘要译文

关键词：

微生物源α-淀粉酶抑制剂; 抑制率; 筛选; 鉴定; 纯化

学位年度：

2013

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

赵丰丽

中图分类号：

Q936[微生物生物化学]

学科分类号：

071003[微生物学];071005[生物化学与分子生物学];100705[微生物与生物技术药物学]