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基于EMA-PCR/qPCR的检疫性有害生物传病风险评估新技术的建立认领

被引量： 4

作者：

熊书

学位授予单位：

重庆大学

摘要：

柑橘溃疡病（Xanthomnas citri subsp.citri）是严重危害柑橘产业发展的重要病害之一，列入2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物》名录。茄科植物青枯病（Ralstonia solanacearum）寄主范围广泛，病原菌在土壤中长期存活，造成巨大的经济损失。目前，常规PCR技术和实时荧光定量PCR技术已经因具有较高的特异性、灵敏性等优势已经广泛地运用于以上植物病原细菌的检测鉴别中。然而传统的基于DNA为检测靶标的PCR方法，能扩增死菌、活菌、活的不可培养菌以及残存的DNA，因而无法准确检测出活菌。而实践中很多时候需要区分死、活细胞或只需要检测残存的活细胞，比如医学上检测感染的治疗效果、植物检疫上检测病原菌除害处理效果、植物病害风险评估等，因为只有活细胞才有危害风险存在，因而传统的基于DNA的PCR检测方法往往使检测结果出现较高的假阳性。同时，植物病原细菌“活的不可培养的状态”（Viable but Non-Culturable，VBNC）的研究也逐步广泛并深入，许多重要的植物病原细菌会在一定条件下进入VBNC状态，从而能逃过常规培养分离法的检测成为“隐性”传染源，导致检测假阴性结果,而处于VBNC状态的病原菌可能会重新恢复并重获致病性而成为初侵染源，导致田间病害发生与流行。因此迫切需要一种能特异、准确、快速检测植物病原细菌活菌方法。特异性核酸染料叠氮溴乙锭（Ethidium monoazide bromide，EMA），一种能与DNA分子紧密共价结合的荧光染料。EMA分子进入死、活细胞时有选择性，仅仅能进入细胞壁和细胞膜不完整的死细胞内，而活细胞完整的细胞膜系统能阻止EMA分子的进入。将EMA染料对死活细胞的选择渗透性与现有的PCR分子技术有效结合起来，建立一种活菌检测的快速、灵敏PCR方法，仅以活的微生物的基因组DNA为检测靶标，能克服传统PCR无法区分死活菌的弊端，有效降低传统PCR检测的假阳性，以及平板计数法在检测VBNC状态病原菌时带来的假阴性结果，使检测结果更加科学、准确、可靠。首先是在制备PCR扩增的DNA模板前经EMA渗透预处理，优化出纯培养条件下区分能有效区分死、活菌的最适EMA浓度以及PCR体系；然后将纯培养条件下建立的EMA-PCR检测体系用于检测处于VBNC状态的病原菌，判断检测结果；最后将该技术用于带菌实际样品的检测中；取得的主要研究结果： ①柑橘溃疡病菌EMA-PCR快速活体检测技术的建立：根据柑橘溃疡病菌独有的保守蛋白基因设计特异性引物扩增出278bp的靶带，PCR反应的检测下限为25个细菌/25μL或2.75pg/25μL。EMA-PCR结果表明：当卤钨灯曝光时间1min，EMA终浓度为1.0mg/L时，能有效抑制1.0×10～8CFU/mL死菌的扩增；当EMA的浓度小于30mg/L时, EMA对上述相同浓度活菌靶基因的扩增没有明显的抑制。EMA-PCR对死活混合菌的扩增表明，活菌数在6.875×10～1-6.875×10～5CFU/PCR范围时，荧光强度与混合体系中活菌的对数值有线性关系（R2=0.934）。基于以上建立的EMA-PCR活体检测技术，对重庆、广西等地采集了共12份疑似柑橘溃疡病症状的叶片和果实样品进行检测，与常规PCR技术和平板计数法比较，结果发现能降低柑橘溃疡病菌检测过程中的假阳性。 ②茄科青枯菌EMA-qPCR活菌检测体系的建立：根据青枯菌UDP-3-O-acyl-GlcNAc deacetylase基因设计特异引物RSF/RSR，扩增目的片段长度为159bp。终浓度为2.0mg/L的EMA能有效排除1.0×10～7CFU/mL灭活青枯菌细胞DNA的扩增，对活细胞和不可培养状态（Viable but Non-Culturable，VBNC）的活菌的DNA扩增均没有影响。当活菌浓度≤10～7CFU/mL和EMA浓度≥40mg/L时，对活细胞的靶基因扩增有显著的抑制作用（P<0.05）。可见，影响活细胞DNA扩增的EMA浓度（40mg/L）远远大于抑制死细胞DNA扩增的最小EMA浓度（1.5mg/L）。当每个定量PCR反应体系中的活细胞在5.0×10～0-5×10～4CFU范围内时，扩增Ct值与定量PCR反应体系中活细胞CFU对数值呈良好的负相关性（R2=0.9925）。比较EMA-qPCR法和平板计数法对经过不同温度短期保存的青枯菌检测结果发现，待检样品可在24℃与4℃冷藏条件下短期保存。人工接菌模拟土壤带菌测试表明，土壤直接提取DNA的qPCR扩增检测对土壤中青枯菌的最低检测限能达到10～2CFU/g，且当土壤中的菌含量在10～7CFU/g-10～2CFU/g范围内，每g土壤所含菌量的对数值与Ct值有线性关系（R2=0.995）；去除颗粒的土壤上清液提取DNA的qPCR扩增检测表明，检出下限比直接提取DNA增加了1个数量级，为10～3CFU/g，当EMA终浓度为50mg/L，可以抑制10～6CFU死细胞/g土壤的DNA扩增，在死菌浓度大于10～6CFU/g时，可以部分抑制死细胞的扩增。本研究探讨了EMA-PCR（qPCR）方法在病原菌纯培养条件下区分死细胞与活的可培养细胞以及VBNC状态细胞的可能性，优化了整个检测的EMA染色制样流程，同时初步建立了EMA-PCR（qPCR）方法用于柑橘实际样品和青枯菌土壤样品中病原菌活菌检疫检验的方法，以期为植物青枯病的检验检疫防控提供更科学、准确的技术支持。

摘要译文

关键词：

柑橘溃疡病菌; 茄科青枯菌; 死菌与活菌

学位年度：

2013

学位类型：

硕士

学科专业：

生物学

导师：

王中康

中图分类号：

S41-30[植物病害、虫害及杂草检疫]

学科分类号：

0904[植物保护]

D O I：

10.7666/d.D356756