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第一部分 4，5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素及其与格尔德霉素生物合成PKS后修饰的关系第二部分必特螺旋霉素生物合成调节基因acyB2在大肠杆菌中的异源表达认领

作者：

牛沂菲

学位授予单位：

北京协和医学院

摘要：

格尔德霉素(geldanamycin,GDM)是一种苯(醌型)安莎类抗生素,是分子伴侣热休克蛋白90(Hsp90)的特异性抑制剂,具有抗肿瘤和抗病毒等生物学活性。但是,GDM具有严重的肝脏毒性,且水溶性和光稳定性较差,限制其开发成为药物,因此,它只作为一个重要的抗肿瘤药物开发先导化合物。近年来,寻找水溶性好、肝毒性低的格尔德霉素衍生物成为新的研究热点。本文通过对吸水链霉菌17997格尔德霉素生物合成PKS后修饰gdmN-(编码氨甲酰基转移酶)变株的次级代谢产物分析,发现了一个预期的新格尔德霉素衍生物,4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素。gdmN变株发酵上清液乙酸乙酯提取后,进行硅胶板TLC分析；对一个红色目标化合物进行HPLC和高分辨质谱分析,并对其进行了1H-和13C-核磁共振分析；对红色目标化合物在吸水链霉菌17997格尔德霉素PKS基因阻断变株中进行了生物转化实验。结果显示：在gdmN-变株发酵产物中发现了1个预期的红色目标化合物(4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素)；该化合物可被格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统7-O-氨甲酰化,生成4,5-双氢-19-S-甲基格尔德霉素,但不能C-4,5氧化。 4,5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基-19-S-甲基格尔德霉素的发现,以及早期发现的19-S-甲基格尔德霉素和4,5-双氢-19-S-甲基格尔德霉素,加深了对天然存在于吸水链霉菌17997格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统以外修饰的认识。通过分析生物转化产物,证实19-S-甲基化修饰对格尔德霉素生物合成PKS后修饰系统中的氨甲酰基化没有影响,而对C-4,5氧化具有抑制作用。必特螺旋霉素是由基因工程重组菌Streptomyces spiramyceticus WSJ-1产生的一组以4"异戊酰螺旋霉素为主组分的十六元大环内酯类抗生素。将来自碳霉素生物合成中的4"异戊酰基转移酶(ist, carE或acyB1)基因导入到螺旋霉素产生菌中,所表达的酶可以对螺旋霉素进行4"异戊酰化。已知acyA和acyB1-acyB2这3个基因,acyA主要负责十六元内酯环上C3-羟基的乙酰基化。而acyB1-acyB2负责十六元内酯环C5上连接的糖基的异戊酰基化。acyB1基因编码4"异戊酰基转移酶。Arisawa等人推测acyB2基因是acyB1基因的正调控基因,但是acyB2的表达产物对acyB1基因的调控结合位点并不清楚。本研究的目的是确证acyB2基因表达产物的DNA结合区,为acyB2基因是acyB1基因的正调控基因提供直接证据；同时,将为应用生物技术手段构建必特螺旋霉素高产菌株提供更加坚实的理论依据。我们首先将acyB2基因克隆到pMD18-T Simple Vector上,获得pMA01基因重组质粒并测序验证无误。然后,采用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切,切下acyB2基因并插入到冷休克表达载体pCold Ⅱ Vector (利用大肠杆菌冷休克基因cspA启动子序列的蛋白质表达系统,采用低温诱导方法,蛋白质表达量和可溶性较高)中,获得pCA01重组质粒。将pCA01重组质粒导入到E. coli Competent Cell BL21中进行异源表达,发现目的蛋白以包涵体形式存在。随后尝试更换表达宿主,Chaperone Competent Cells BL21系列——分别含有一种伴侣蛋白质粒,能有效表达一组协同作用、共同参与蛋白折叠的分子伴侣(以增加可溶性蛋白表达水平),但仍没有获得可溶性目的蛋白。最后,我们对以包涵体形式表达的目的蛋白进行了纯化和复性。 acyB2与acyB1间有段约300bp的DNA片段,我们推测其中可能包含acyB2编码蛋白的DNA结合区(以正调控acyB1转录表达)。我们设计PCR引物,扩增该300bp DNA片段,标记后作为探针,利用凝胶阻滞实验,以确证acyB2蛋白的DNA结合位点,但是没有成功。

摘要译文

关键词：

gdmN-; 格尔德霉素生物合成; PKS后修饰; 必特螺旋霉素; 异戊酰基转移酶基因; 正调节基因; 蛋白表达

学位年度：

2012

学位类型：

硕士

学科专业：

微生物与生化药学

导师：

武临

中图分类号：

TQ927[发酵法制抗菌素]

学科分类号：

081703[生物化工];082202[发酵工程];083604[生物过程工程];083606[微生物发酵工程]

D O I：

10.7666/d.Y2123314