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FK506生物合成基因簇中甲氧基丙二酰ACP的异源表达研究认领

被引量： 2

作者：

王海娜

学位授予单位：

大连理工大学

摘要：

聚酮化合物是细菌、真菌或植物来源的、由低级羧酸通过连续缩合生成的一大类次级代谢产物,多种在临床和农牧业上有着重要用途的抗生素属于聚酮类化合物。FK506是一种具有免疫抑制活性的聚酮类化合物,因其高效低毒的特性被学者认为是临床上最具潜力的免疫抑制剂。由于FK506的原产菌产量比较低,使得通过发酵培养来提取次级代谢物的过程变得复杂而困难。因此利用生长速度较快,可实现规模发酵培养的大肠杆菌或遗传背景清晰、易于分子生物学操作的链霉菌进行FK506的异源合成是一条新的解决途径。 FK506生物合成过程中较为特殊的一个延伸单位为甲氧基丙二酰ACP(MM-ACP),其生物合成基因簇包含fkbG,fkbH, fkbl, fkbJ和fkbK五个基因。本课题通过基因工程的方法将合成MM-ACP的五个基因进行单独克隆,构建了含有单个基因的表达载体pETG,pETH,pETI,pETJ和pETK,以及五个基因的串联表达载体pETGK,同时还构建了基于核糖体DNA同源整合的表达载体pZHGK。将构建好的重组载体转化进入大肠杆菌BAP1中进行蛋白的诱导表达,得到了大小正确的目标蛋白产物,并研究了提高蛋白可溶性表达的策略,利用带有链霉菌伴侣蛋白的表达载体pL1SL2获得了可溶目的蛋白。海洋放线菌是进行新颖活性物质生产的重要来源。本实验室前期分离鉴定了一株海洋链霉菌新种星海链霉菌,对其基因组测序结果分析表明,该菌种具有生产聚酮类化合物、氨基糖苷类化合物、非核糖体多肽类化合物等多种次生代谢物的潜力,可作为生产聚酮化合物的异源表达宿主。本课题对该菌株进行了遗传转化体系的建立研究,首先研究了合适的培养基,发现高氏一号培养基为合适的生孢子培养基；其次,对可以使用的遗传转化标记进行了研究,结果表明,安普霉素、硫链丝菌素等抗生素可以作为星海链霉菌的筛选标记。利用pSET152整合载体,成功进行了结合转移操作,获得了较高的结合转移效率。本论文的研究结果为实现MM-ACP在大肠杆菌中的异源表达奠定了基础,也为研究MM-ACP的拷贝数对FK506异源生产的影响提供了前提。同时,星海链霉菌遗传转化体系的建立,为进一步开发其作为异源表达宿主,进行FK506等重要的次生代谢产物的生产提供了良好的理论依据。

摘要译文

关键词：

聚酮化合物; FK506; 甲氧基丙二酰ACP(MM-ACP); E. coli; 星海链霉菌; 异源表达

学位年度：

2012

学位类型：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

赵心清

中图分类号：

Q78[基因工程(遗传工程）]

学科分类号：

071005[生物化学与分子生物学];071007[遗传学];083601[基因工程]