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二元信号系统ComD/ComE与肺炎链球菌对β-内酰胺类抗生素耐药的相关性
被引量：
1
作
者：
学
位
授
予
单
位：
摘
要：
目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统(TCS)基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。建立肺炎链球菌comD基因敲除突变株,了解comD基因与细菌β-内酰类抗生素耐药性的相关性,探讨氯氰碘柳胺下调comD、comE和com(?)基因mRNA的作用。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。构建用于comD基因敲除的自杀质粒pEVP3comD,通过同源重组及插入失活获得肺炎链球菌ATCC6306株comD基因敲除突变株comD.采用PCR及免疫荧光法对comD突变株进行鉴定。采用实时荧光定量RT-PCR检测氯氰碘柳胺处理前后comD—突变株及野生株comD、comE和comC基因1nRNA水平变化。采用二倍琼脂稀释法测定comD—突变株及野生株对青霉素G和头孢噻肟的敏感性。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3 pET42a-comD、E.coli BL21DE3 pET42a-comE和E.coli BL21DE3 pET32a-comC(?)有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1：4、1：4和1：8。ComD和／或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。测序及免疫荧光试验结果证实,所构建的comD突变株染色体DNA中comD基因被插入失活。50μmol/L或100μmol/L的氯氰碘柳胺能明显下调comD、comE和com(?)基因mRNA水平(P＜0.05),25μmol/L的氯氰碘柳胺则否。comD突变株对青霉素及头孢噻肟MIC值均为32μg/mL,明显高于野生株的0.06和1μg/mL。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。成功地构建了肺炎链球菌comD基因敲除突变株。comD基因与细菌对p-内酰类抗生素耐药性密切相关。氯氰碘柳胺可通过下调comD, comE和com(?)基因的转录水平,从而对细菌感受态形成产生影响。
关
键
词：
肺炎链球菌; ComD/ComE二元信号传导系统; β-内酰胺类抗生素; 耐药性; 氯氰碘柳胺; 表达调控
学
位
年
度：
2011
学
位
类
型：
硕士
学
科
专
业：
病原生物学
导
师：
中
图
分
类
号：
R446.5[微生物学检验]
学
科
分
类
号：
083101[健康医学工程];083102[医学诊疗技术与器械];100218[临床检验诊断学];100602[中西医结合临床医学]
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