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宇佐美曲霉木聚糖酶基因的克隆、表达及定向诱变研究认领

被引量： 22

作者：

周晨妍

学位授予单位：

江南大学

摘要：

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）以内切方式水解木聚糖分子中的β-1,4-木糖苷键,产生不同链长的寡糖和木糖,是木聚糖降解酶系中最关键的酶。它广泛存在于各种微生物中,在饲料、造纸、食品、医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。根据宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001木聚糖酶（XynⅡ）N末端15个氨基酸残基序列以及真核生物mRNA在3′端存在poly（A）等序列信息,利用RACE技术扩增和克隆了相关的基因片段,获得了XynⅡ的全长cDNA序列和DNA序列,并分析了该序列的有关信息。克隆的cDNA序列、DNA序列的Genbank登录号分别为DQ114485和DQ191144。成熟肽基因推导的氨基酸序列同其他微生物来源的若干G/11族木聚糖酶相比,具有较高的同源性,属内比对,与来源于Aspergillus niger（GenBank登录号:ANU39784）的木聚糖酶同源性最高,达89%。将XynⅡ成熟肽的cDNA序列克隆至pET-28a（+）表达载体中,在大肠杆菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中进行了IPTG诱导表达,木聚糖酶的比酶活最高达49.61U/mg。进而将该基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,转化毕赤酵母GS115和KM71,经筛选获得阳性重组菌PXGL98（Mut+）和PXKL29（Muts）。该木聚糖酶基因在2种毕赤酵母中均实现了分泌表达,工程菌发酵条件优化后,PXGL98与PXKL29发酵液中的比酶活分别可达3139.68 U/mg和3846.83 U/mg。对木聚糖酶XynⅡ进行同源建模和序列比较,定向诱变证明在催化反应中起重要作用的氨基酸残基为Glu-79和Glu-170。研究发现第11族木聚糖酶的催化结构域在B折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点Asp-37,该位点与木聚糖酶的pH特性有关,据此设计了XynⅡ的D37N定向诱变。酶学性质分析显示,XynⅡD37N的最适pH值由4.2升高到5.3,pH稳定范围也向碱性方向偏移,由pH 3.0-7.5变为pH 3.0-9.0。这表明木聚糖酶XynⅡ的第37位Asp与最适pH值相关,为进一步的结构与功能研究提供了理论基础。在XynⅡ的“Ser/Thr”平面引入精氨酸的四点诱变（ST4）和五点诱变（ST5）,对酶的热稳定性进行改造。获得的两个突变酶在热稳定性上比野生型酶都有不同程度的提高。突变酶ST4和突变酶ST5使酶的最适温度分别由原酶的50℃提高为52℃和55℃。55℃保温15 min,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的20%提高为65%和75%;保温1h,ST4、ST5的残留酶活性由原酶的15%提高为50%和65%。该突变酶在保持了XynⅡ优良性质的基础上,进一步提高了其热稳定性,具有更好的应用价值。

摘要译文

关键词：

宇佐美曲霉; 木聚糖酶; 基因克隆; 毕赤酵母; 定向诱变; 催化残基; 最适pH; “Ser／Thr”平面改造

学位年度：

2008

学位类型：

博士

学科专业：

发酵工程

导师：

王武

中图分类号：

Q78[基因工程(遗传工程）]

学科分类号：

071005[生物化学与分子生物学];071007[遗传学];083601[基因工程]