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毛细管电泳分离检测某些疾病特征性物质和手性药物研究认领

作者：

李桦

学位授予单位：

武汉大学

摘要：

生物医学的迅速发展对疾病诊断及治疗药物监测的分析方法提出了更高的要求。氨基酸类神经递质和蛋白质类细胞因子是生物体内重要的生物活性物质，也是某些神经性疾病与癌症的特征性物质。由于氨基酸类神经递质和蛋白质类细胞因子所存在的生物体系基质复杂、组分多且含量低，因此对分析方法的分离度、灵敏度和选择性均有很高的要求。手性药物口服或注射到人体内后，药物分子由血液转移到其作用靶点，药物对映体在血液中浓度的测定及与血清蛋白质结合常数的测定，对于手性药物的药理学和立体选择性药代动力学研究具有重要意义。本论文将毛细管电泳分离技术与激光诱导荧光检测、免疫分析、电动场放大进样等技术相结合，建立了生物样品中的氨基酸类神经递质与一种蛋白质类的巨噬细胞生物活性因子（daintain／AIF1）和四种手性药物卡替诺尔、氟西汀、美多心安和苯海索的高效、灵敏和选择性好的CE分离检测方法，并研究了卡替诺尔和氟西汀与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。在系统查阅有关文献资料的基础上，进行了以下研究工作：（1）以荧光素异硫氰酸酯（FITC）为衍生试剂，建立了毛细管电泳-激光诱导荧光分离测定大白鼠脑皮质中氨基酸神经递质的分析方法。对氨基酸神经递质的衍生条件和CE分离条件进行了系统的考察和优化。最佳衍生反应条件为：5mM硼砂缓冲液（pH9.6），FITC／氨基酸的比例为30：1，室温下（20℃）避光反应16小时。最佳CE分离条件为：在57cm（总长）×75μm（内径）毛细管中，以15mM硼砂缓冲液（pH9.2）为CE背景电解质，分离电压17.5kV，分离温度25℃。在此分离条件下，六种氨基酸神经递质得到基线分离，检测限在2.1×10-11-6.3×10-10M之间。用此CE-LIF法监测了脑缺血所引起的大白鼠脑皮质中各种氨基酸神经递质含量的变化和中药黄芩甙对脑皮质中各种氨基酸神经递质量的影响。研究结果初步表明：脑缺血能引起脑皮质中谷氨酸、天冬氨酸、γ氨基丁酸、甘氨酸含量显著增高；注射黄芩甙能抑制由脑缺血引起的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸含量的增高，证明黄芩甙对神经系统具有保护作用。（2）将竞争性免疫分析法与毛细管电泳—激光诱导荧光法相结合，首次建立了异源移植性感染因子（daintain／AIF1），一种蛋白质类的巨噬细胞生物活性因子的毛细管电泳免疫分析法。将daintain用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记，用高效液相色谱法分离纯化标一记后的daintain。将纯化后的F工Tc一daintain与未标记的 dain七ain和daintain抗体进行竞争性的cE分析。对影响免疫结合反应的实验条件、 CE工A分离条件进行了研究和优化。最佳CEIA条件为:8.0 x 10一“M的daintain抗体、 1.Ox10一‘M FITC一daintain和样品daintain于室温下，在磷酸盐等渗缓冲溶液中温育反应25分钟后，在37（cIn）x 50，m（内径）未涂层的毛细管中，以含0.05%经丙甲基纤维素（HPMC）的硼砂缓冲溶液为背景电解质进行CE分析。在此CEIA分析体系中，游离的F工TC一daintain与抗原抗体复合物在7分钟内得到分离，daintain的检测限为3.4nM，质量检测限为17amol。定量分析相对标准偏差为2.3%一3.8%，回收率为 96.3十98.2%。该毛细管电泳免疫分析法具有灵敏度高、专一性强、无放射性污染的优点。将此方法应用于白血病患儿血清中 dainta如的测定，结果令人满意。（3）在毛细管电泳/紫外检测体系中，以梭甲基一p一环糊精、轻丙基一旦一环糊精、二甲基一p一环糊精为手性选择剂，对四种手性药物:卡替诺尔（Carteolol）、氟西汀（fluoxetine）、美多心安（metoprolol）和苯海索（trihex邓henidyl）进行了手性分离研究。实验发现:荷电性的梭甲基一p一环糊精（CM一p一CD）对四种手性药物具有最佳手性拆分效果。以CM一p一CD为手性选择剂，对 CE背景电解质中CM一p一CD浓度和pH值、操作电压和温度等操作参数进行了优化，建立了四种手性药物的CE分离方法。四种药物对映体在各自的最佳CE分离条件下，分别在13一26分钟内，得到完全分离。苯海索、美多心安、卡替诺尔和氟西汀四种对映体的检测限分别为12.sp M、10.1 pM、1.83协M和5.10pM。回收率在99.2一102.1之间。该分析方法具有手性分离度高、快速和操作简单的特点。（4）将电动场放大进样技术和毛细管电泳手性分离技术相结合，首次建立了氟西汀、美多心安、苯海索和卡替诺尔四种手性药物的电动场放大进样/毛细管电泳（FAS工/CE）分离检测方法。对影响灵敏度增强因子的电动场放大进样操作条件作了系统的研究和优化。最佳条件为:采用80/20的甲醇/水混合液（含30一80 p M H3P04）作为样品溶液;予进样水塞（0.sp.5.1，55）后，以电动进样（10一15kV， 55）的方式进样、毛细管电泳手性分离。在该条件下，氟西汀、卡替诺尔、苯海索和美多心安对映体的检测限分别为10.InM、1.81 nM、26.0 nM和17.snM;与普通流体力学压力进样方式相比，四种药物对映体的检测灵敏度提高480一1000倍。该FAS工/CE分析方法具有灵敏度高、操作简便和分析成本低的特点。将此分析方法应用于血清中卡替诺尔和氟西汀对映体的分离测定，结果令人满意。（5）在毛细管电泳一激光诱导荧光检测系统中，以4一氟一7一硝

摘要译文

关键词：

毛细管电泳; 氨基酸神经递质; 蛋白质; 手性药物; 激光诱导荧光检测

学位年度：

2004

学位类型：

博士

学科专业：

分析化学

导师：

张华山

中图分类号：

O658.9[其他⑨]

学科分类号：

070302[分析化学];081704[应用化学]

D O I：

10.7666/d.Y632439