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I.人甲状旁腺素1～34肽的制备 II.人胸腺素α1的制备及其与干扰素α-1b的融合表达认领

作者：

修朝阳

学位授予单位：

中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

摘要：

第一部分：人甲状旁腺素1-34肽的制备第一章：人甲状旁腺素1-34肽的化学合成目的以wang树脂为载体，应用Fmoc/tBu方法合成人甲状旁腺素。方法 Fmoc保护氨基酸用TBTU/HoBt活化后，进行缩合反应。合成的多肽用TFA处理，从wang树脂上切除。所得粗肽用SP-Sepharose-FF层析柱和半制备型HPLC分离纯化。结果用RPHPLC和毛细管电泳法鉴定纯度在92%以上。通过电喷雾质谱法测定其分子量为4116Da，与计算值相符。总收率为8%。结论本工艺简单，易于扩大，适合于规模化生产。第二章：人甲状旁腺素1-34肽的基因工程表达采用全基因分段合成和补丁连接相结合的方法构建了人甲状旁腺素（hPTH）（1～34）肽基因，并利用GST融合表达系统，在大肠杆菌中克隆和可溶性表达了hPTH（1～34）肽基因。融合蛋白表达量占菌体总蛋白质的25%以上，经高密度发酵、亲和纯化后，融合蛋白的纯度达到了90%以上。融合蛋白分别经过酶切后加工后，可以得到天然的人甲状旁腺素（1～34）肽纯品，样品的理论回收值达到了24.4%和48.75%。产物的纯度和性质经HPLC、毛细管电泳、质谱分析、N端测序等得到证明，并与化学合成产物的结果相吻合。兔肾皮质细胞测活表明，重组产物与化学合成人甲状旁腺素（1～34）肽具有相近的腺苷酸环化酶激活活性。第二部分：人胸腺素α1的制备及其与人干扰素α-1b的融合表达研究第一章：人胸腺素α1的化学合成本文以Fmoc保护氨基酸和wang树脂为原料，TBTU-HoBt为缩合剂。采用固相多肽合成方法制备胸腺素α1。用TFA切肽后，产品的平均总收率可达13%以上。本工艺简单，易于扩大，适合于规模化生产。第二章：人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达利用基因工程表达的方法，在大肠杆菌中通过融合方式高效表达了胸腺素α1前体基因，随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式，得到了胸腺素前体肽段31肽和N-端未经乙酰化的28肽。其中融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%-40%，样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定，分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明，所构建的GST-Tα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用，其中N-端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近，均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。第三章：人胸腺素α1与人干扰素α-1b的融合表达研究为了构建人胸腺素α1与干扰素α1-b的融合蛋白(TA1-IFN)，以获得高活性免疫功能的新型基因工程药物。本文采用了3'-末端互补高温聚和酶延伸与PCR相结合的方法，人工合成了TA1-IFN融合基因。在融合基因中，5'端为人胸腺肽α基因，3'端为干扰素α1-b基因，两者中间采用GGGGSSGGGG连接肽段进行连接。在基因构建的过程中，还同时修改了融合基因中的部分密码子，尤其是精氨酸密码子，将这部分在大肠杆菌中比较稀有的密码子转换成大肠杆菌的优选密码子。合成的基因克隆到pET-22b(+)载体中，获得了表达质粒pET-TIN，转化大肠杆菌BL21(DE3)获得了高效表达工程菌。表达后的融合蛋白以包含体的形式存在，其含量达到了菌体总蛋白的20%左右。包含体蛋白复性后经Q-Sepharose柱和Hiload 26/60 Sephadex75柱分离纯化，可得到TA1-IFN融合蛋白产物，其纯度达到95%以上。融合蛋白在保留了TA1和IFNα1-b活性的同时，还表现出一定程度上的协同增强作用。另外，还在文中对TA1-IFN融合蛋白的二级结构进行了模拟预测

摘要译文

关键词：

胸腺素α; 干扰素α; 大肠杆菌; 甲状旁腺素; PTH; 双酶切; 肠激酶

学位年度：

2002

学位类型：

博士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

王德宝陈常庆

中图分类号：

Q78[基因工程(遗传工程）]

学科分类号：

071005[生物化学与分子生物学];071007[遗传学];083601[基因工程]