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MerTK缺陷通过抑制胞葬作用加重耐药性癫痫神经炎症及认知障碍的机制研究认领

作者：

王先美

学位授予单位：

贵州医科大学

摘要：

耐药性癫痫(Pharmacoresistant Epilepsy,PRE)以反复癫痫发作和进行性认知功能损害为核心特征,神经炎症被证实是介导其病理进程的关键机制,然而,导致神经炎症持续高反应的“根源”仍不明确,且它是PRE形成的驱动因素还是作为疾病进展的继发性结果促进癫痫恶化尚存争议。既往研究表明,致痫区大量神经元凋亡并释放损伤相关分子模式(Damage-Associated Molecular Patterns,DAMPs),进而激活炎症反应并加剧神经损伤,形成“神经元死亡-炎症”恶性循环,死亡细胞清除机制可能是打破这一循环的核心环节。胞葬(Efferocytosis)是特异性清除凋亡细胞的关键过程,其功能缺陷可导致凋亡细胞堆积、继发性坏死及DAMPs持续释放,推动神经炎症慢性化。Mer受体酪氨酸激酶(Mer Receptor Tyrosine Kinase,MerTK)是胞葬的核心受体,在炎症性疾病中发挥关键作用,但PRE中持续神经炎症是否由胞葬缺陷介导、上调MerTK增强胞葬能否减轻炎症并改善认知功能仍不明确。为此,本研究从临床出发,采用多种动物模型,结合蛋白质组学技术和基因调控方案,探讨神经炎症在PRE病程中的角色及胞葬作用与PRE神经炎症反应及认知功能的关联。目的: 1.通过回顾性队列研究、炎症大鼠模型、癫痫大鼠模型及PRE大鼠模型,了解系炎症反应对痫性发作的影响,并一进步探析炎症与癫痫耐药形成间的因果关系,为阐释PRE神经炎症机制提供实验依据。 2.通过蛋白质组学组学技术探析参与PRE神经炎症反应、细胞死亡及认知障碍相关的分子及通路,为探寻细胞死亡后的清除机制与神经炎症反应间的关联提供实验依据。 3.采用腺相关病毒(Adeno-Associated Virus,AAV)对PRE大鼠胞葬受体MerTK进行上调及干扰,探析胞葬作用对PRE大鼠神经炎症反应及认知功能的影响,为阐释PRE神经炎症驱动机制及认知功能障碍机制提供新的视角,同时也为PRE癫痫发作治疗策略的制定提供新的思路。方法: 1.临床部分:采用单中心、回顾性研究方法,根据纳入/排除标准,最终纳入病例414例,根据入院主诉是符合痫性发作分为2组,分析2组病例一般资料、重要病史资料及血常规炎症指标,包括中性粒细胞(Neutrophil,NUE)、淋巴细胞(Lymphocyte,LYM)、中性粒细胞与淋巴细胞比率(Neutrophil-to-Lymphocyte Ratio,NLR)及白细胞。在亚组分析中根据NLR值段进行分组,本研究将具有相近的癫痫发作率NLR值段分为一个组,最终将414例病例分为6组,即NLR值小于1组、NLR值1-2组、NLR值2-3组、NLR值3-5组、NLR值5-10组和NLR值大于10组。 2.炎症模型构建、分组及鼠尾静脉血采集:根据炎症模型构建方式,分为4个组,分别是对照(Control,CON)组、假手术组(Sham)组、颅内炎症模型组(Intracranial Inflammation,ICI)组、系统炎症模型(Systemic Inflammation,SI)组。ICI模型构建方法为在麻醉状态下通过颅内立体定向注射5μL脂多糖溶液(4μg/μL)。SI模型构建方法为腹腔注射LPS溶液,剂量为750μg/kg,每日1次,连续5天。Sham组:颅内注射无菌生理盐水5μL,注射及护理方法同ICI组。CON组不做任何干预。于第6日,构建癫痫模型前采集4组尾静脉血行血常规检查并分析组间NUE、LYM、白细胞及NLR差异。 3.耐药性癫痫模型构建及分组:炎症模型构建成功后于次日采用匹罗卡品-氯化锂诱导癫痫模型,采用苯妥英钠及苯巴比妥对癫痫模型进行耐药性筛选。分为3组,即CON组、药物敏感性癫痫(Pharmacosensitive Epilepsy,PSE)组、PRE组。 4.行为学分析:本研究采用Y迷宫及Morris水迷宫检测各组大鼠认知水平。 5.蛋白质组学:采集CON组、PSE组及PRE组脑组织行蛋白质组学分析。 6.MerTK AAV构建及分组:为了实现对PRE大鼠脑内MerTK基因表达的调控,本研究构建MerTK AAV载体,并采用颅内定向注射的方法,将MerTK AAV定向注射至大鼠海马区。在病毒注射3周后,随机选取部分大鼠,通过免疫荧光染色检测海马及颞叶区域MerTK表达水平。进一步通过Q-PCR及Western blot检测各组MerTK m RNA及蛋白水平,以验证MerTK AAV转染效率。MerTK AAV调控分组如下: 1)CON组:正常对照,不施加干预; 2)PSE组:癫痫药物敏感大鼠,无额外处理;3)PRE组:癫痫耐药大鼠,不进行任何干预; 4)UPRE组:对PRE大鼠实施颅内定向注射过表达MerTK的腺相关病毒; 5)UPRC组:向PRE大鼠颅内定向注射过表达AAV空载体,作为对照; 6)DPRE组:对PRE大鼠颅内定向注射携带MerTK干扰元件的AAV,以干预下调MerTK; 7)DPRC组:向PRE大鼠颅内定向注射干扰AAV空载体,作为对照。 7.其他分子生物学实验方法: 1)透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)、H&E染色、NISSL染色:脑组织细胞减少/凋亡及损伤; 2)ELISA及Q-PCR:检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的表达; 3)Western blot及Q-PCR:检测HMGB1、NLRP3、IL-6、TNF-α、IL-1β及MerTK的表达; 4)免疫组化及免疫荧光:检测MerTK、PSD95的表达。结果: 1.系统感染显著增加痫性发作风险。入院主诉为痫性发作组癫痫病例感染暴露率显著高于对照组(52.0%vs 37.8%P=0.007),其中主要为肺部感染,占总并发感染病例的64.9%。二元logistic回归结果显示,暴露于感染的癫痫患者痫性发作的风险是未暴露于感染的癫痫患者的1.788倍(OR=1.788,95%CI:1.182-2.703,P=0.006),提示系统感染是癫痫患者癫痫发作的独立危险因素。 2.外周血炎症指标NLR是痫性发作早期的炎症预警信号。伴有痫性发作组癫痫病例与对照组间炎症指标NEU、LYM及NLR差异无统计学意义(P>0.05)。亚组分析结果显示,NLR与痫性发作率并非线性相关性,而呈“V”型关联。NLR值为2-3组病例痫性发作率最低(49.2%),与其他组别间差异具有统计学意义(P<0.05)。NLR值小于2时,NLR值与痫性发作呈负相关关系,NLR值大于3时,NLR值与痫性发作呈正相关关系。NLR值小于2的病例具有显著增高的脑血管病病史及更低的年龄(P<0.05),揭示结构性病因对癫痫发作的影响;NLR值大于3的病例更多的暴露于感染,体温显著高于NLR值小于3的病例(P<0.05),血液炎症指标方面,表现为NEU异常增大及LYM异常降低(P<0.05),表明NLR值升高与更严重的感染和炎症反应相关,揭示炎症反应与癫痫发作的密切关联,炎症指标NLR升高作为癫痫病人痫性发作预警信号的价值。 3.LPS诱导的ICI炎症模型组及SI炎症模型组尾静脉血NEU及NLR显著高于Sham组及CON组,LYM百分百显著低于Sham组及CON组(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间无显著差异(P>0.05),组间白细胞数及NEU绝对值组间差异无统计学意义(P>0.05)。此外,LPS诱导的ICI炎症模型组及SI炎症模型组脑组织IL-6及TNF-α显著高于Sham组及CON组(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间差异无统计学意义(P>0.05)。此结果提示LPS诱导的系统炎症及颅内炎症均介导外周血炎症指标升高及颅内炎症因子上调。 4.在癫痫模型构建阶段,LPS诱导的ICI炎症模型组(90.5%)及SI炎症模型组(83.3%)持续性痫性发作诱导率显著高于Sham组(65.6%)及CON组(60.8%)(P<0.05),ICI组及SI组间,Sham组及CON组间无显著差异(P>0.05),提示颅内炎症及系统炎症皆可提高痫性易感性,是癫痫发作的重要影响因素。对癫痫大鼠进行耐药性筛选后本研对大鼠模型的有效性进行了验证,脑电图结果显示,PRE大鼠较PSE及CON组大鼠表现出显著异常的放电模式。TEM兴奋性突触检测结果显示,PRE组大鼠海马区兴奋性突触较PSE组及CON组大鼠显著增多,此外,采用多种方法检测了兴奋性突触中的关键调节因子PSD95,结果显示,PRE组大鼠PSD95表达较PSE组及CON组显著上调(P<0.05),此结果提示PRE模型突触结构与功能均发生重塑,驱动神经微环境向兴奋-抑制失衡方向转变。上述结果表明,本研究通过反复癫痫发作、特征性脑电图改变及神经微环境变化证据,成功构建了符合临床特征的PRE大鼠模型。本研究统计并分析了4组间PRE的筛出率,结果显示组间差异无统计学意义(P>0.05),提示构建癫痫模型前LPS诱导的颅内炎症及系统炎症不是PRE形成的直接驱动因素。 5.本研究检测了PRE大鼠脑组织炎症因子及炎症反应中的关键分子。结果显示PRE组大鼠脑组织炎症因子IL-6和TNF-α的表达显著高于PSE组和CON组(P<0.05),此外,损伤相关分子模式HMGB1及炎症小体NLRP3的表达也显著上调(P<0.05),小胶质细胞重要的标志物IBA-1的表达也较CON组显著上调(P<0.05),此结果提示PRE大鼠神经炎症反应增强,结合前期LPS诱导的颅内炎症及系统炎症不是PRE形成的直接驱动因素的研究结论,PRE大鼠高神经炎症反应可能是癫痫发作的继发性后果。通过TEM观察发现,PRE组大鼠海马区凋亡细胞数量显著高于PSE组和CON组。H&E染色和Nissl染色进一步证实PRE组大鼠海马区细胞丧失较PSE组和CON组显著增加,且受损细胞数目明显增多,尤其是在CA1和CA3区。以上结果表明,细胞丧失/死亡与炎症反应共同参与PRE病理进程。 6.蛋白质组学分析结果显示,PRE组与PSE组相比上调的蛋白在突触信号的调控、认知、学习及反式突触信号的调控等通路显著富集(富集倍数5,P<0.05),PRE组与PSE组相比下调的蛋白在谷氨酸受体信号通路、Ephrin受体信号通路、胞吞作用及细胞表面受体蛋白酪氨酸激酶信号通路等显著富集(富集倍数15,P<0.01)。c AMP信号通路、谷氨酸能突触、钙信号通路、MAPK信号通路、ras信号通路、TNF信号通路、炎症介质对TRP通道的调节及胞吞作用等信号通路被显著富集出来。Tyro3、MerTK、Egr3及Syk等蛋白参与了细胞信号传导和免疫调节等多个生物过程,其中包括细胞表面受体酪氨酸激酶的信号传递、白细胞活性的调节、细胞活化的控制、淋巴细胞功能的调节、自然杀伤细胞的激活以及B细胞活化的调控,被显著富集。从蛋白质表达角度揭示细胞死亡、胞吞作用、炎症及突触调控参与PRE病理进程。本研究对蛋白质组学富集出来的、在炎症反应及死亡细胞清理过程中具有核心作用的胞葬受体MerTK采用多种方法进行了验证,结果显示,PRE组大鼠脑组织胞葬受体MerTK表达较PSE组及CON组大鼠显著减少(P<0.05)。此结果表明PRE组大鼠脑组织中存在明显的胞葬缺陷,结合前期PRE大鼠神经炎症反应增强的结果,揭示了PRE病程中胞葬缺陷与神经炎症反应间的密切关联。本研究采用Y迷宫及Morris水迷宫测试了各组大鼠的认知水平,结果显示,PRE组大鼠索行为减少,潜伏期延长,穿越中心平台的次数减少,且学习和适应环境的能力较PSE组及CON组大鼠显著减弱(P<0.05),表明PRE伴有显著的认知功能受损。 7.成功转染MerTK 3周后,进行为期2周的视频监控,结果显示,UPRE组癫痫发作频率及持续时间较PRE组显著降低(P<0.05),DPRE组与PRE组间无显著差异(P>0.05)。H&E染色和Nissl染色结果显示,UPRE组大鼠CA1、CA3及DG区细胞较PRE组细胞数量显著增加,

摘要译文

关键词：

耐药性癫痫; 痫性发作; 炎症; 胞葬; MerTK; NLR

学位年度：

2025

学位类型：

博士

学科专业：

转化医学

导师：

伍国锋

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27045/d.cnki.ggyyc.2025.000028