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ASS1/PHGDH在三阴性乳腺癌发展中的作用及其机制研究认领

作者：

罗文松

学位授予单位：

中南大学

摘要：

背景:乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤,是引起女性癌症死亡的重要病因,且在分子水平上是一种异质性疾病。其中三阴性乳腺癌（TNBC）具有复发率高、侵袭性强、恶性程度高等特征,是最难治疗的一种亚型。因此,迫切需要对该疾病的发生、发展机制开展全面和深入的研究,以探索新的治疗靶点,进而改善并提高对该疾病的治愈。精氨酸代琥珀酸合成酶（ASS1）是尿素循环中的一个关键酶,催化精氨酸的合成。研究表明,ASS1在多种肿瘤中低表达,发挥肿瘤抑制因子的功能。然而,目前对ASS1抗肿瘤的机制研究仍不详尽。我们以前的工作表明,ASS1的激活剂LM-2I能够增强ASS1酶活性,通过减少嘧啶的合成发挥抗癌功能。然而,补充嘧啶核苷酸只能部分挽救细胞的生存能力,这表明ASS1可能存在其他抗肿瘤途径。目的:探索ASS1蛋白互作的信号转导途径,蛋白之间相互作用方式和调控方式。阐明ASS1在TNBC中发挥抗肿瘤功能的新机制,为TNBC的治疗提供新的途径和策略。方法:利用免疫共沉淀（Co-IP）-液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）探索ASS1的潜在互作蛋白,通过Western blotting（WB）、Co-IP、GST-pulldown、免疫荧光共定位、免疫组化（IHC）、RT-q PCR和体内泛素化实验明确相互作用关系和蛋白互作的调控方式。采用LC-MS/MS和气相色谱-质谱联用（GC-MS）靶向代谢组学检测细胞内总丝氨酸和甘氨酸水平及丝氨酸和甘氨酸的从头合成。采用MTT、克隆形成和裸鼠移植瘤实验检测ASS1、PHGDH、及丝氨酸和甘氨酸对TNBC生长的影响。结果:（1）免疫共沉淀-液相色谱-串联质谱发现ASS1潜在互作蛋白磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）,Co-IP和GST-pulldown实验显示在TNBC细胞中ASS1与PHGDH直接结合。免疫荧光共定位实验显示,二者在TNBC细胞质中存在共定位。PHGDH和ASS1不同氨基酸区段截短蛋白的GST-pulldown和Co-IP实验显示PHGDH的N-314区段与ASS1 N-173和174-377区段均能结合。（2）相比正常乳腺上皮细胞,PHGDH的蛋白和mRNA在乳腺癌细胞系中表达较高。ASS1敲除上调PHGDH蛋白表达,而过表达抑制PHGDH蛋白表达,且PHGDH mRNA水平无明显变化。PHGDH敲除、敲低或过表达对ASS1蛋白表达无明显影响。而且,ASS1与PHGDH在TNBC病人组织中免疫组化（IHC）结果显示,复发病人中ASS1低表达,PHGDH高表达;非复发病人中ASS1高表达,PHGDH低表达,二者表达呈负相关。（3）BafA1处理ASS1敲除或过表达TNBC细胞,PHGDH蛋白表达无明显变化。ASS1基因敲除上调PHGDH蛋白表达,但MG132处理减弱了ASS1基因敲除的促进作用。ASS1的过表达降低了PHGDH蛋白表达,但MG132的处理减弱了ASS1过表达的抑制作用。CHX处理TNBC细胞,ASS1过表达促进PHGDH蛋白降解,而ASS1敲除抑制蛋白降解。细胞体内泛素化实验显示,HEK293T细胞中ASS1促进PHGDH泛素化,而乳腺癌细胞MDA-MB-468中敲除ASS1抑制PHGDH泛素化。（4）PHGDH是丝氨酸从头生物合成途径中的第一且唯一的限速酶,丝氨酸又能进一步生成甘氨酸。因此,通过GC-MS靶向代谢组分析丝氨酸和甘氨酸合成,LC-MS/MS检测细胞中丝氨酸和甘氨酸水平。结果显示,ASS1过表达能够减少丝氨酸和甘氨酸中13C6的掺入量以及细胞中丝氨酸和甘氨酸的总含量,而PHGDH敲除能够明显减弱ASS1抑制丝氨酸合成的功能。（5）体内外实验表明,ASS1能够抑制TNBC细胞生长,且PHGDH的敲除能够明显减弱ASS1对TNBC细胞生长的抑制作用,在体内ASS1敲除依旧上调PHGDH蛋白表达。（6）细胞体外增殖实验表明,剥夺细胞外源丝氨酸和甘氨酸抑制TNBC细胞增殖,且明显增强ASS1过表达、PHGDH敲除或敲低对TNBC细胞增殖的抑制,然而ASS1敲除或敲低后能够极大回复细胞的增殖能力。补充外源丝氨酸和甘氨酸能够挽救ASS1过表达对TNBC细胞增殖的抑制。结论:ASS1与PHGDH直接结合,ASS1负调控PHGDH蛋白表达,且TNBC组织中二者蛋白表达呈负相关。ASS1敲除或敲低通过稳定PHGDH蛋白水平促进丝氨酸和甘氨酸合成,从而促进TNBC生长,且PHGDH敲除或敲低能够明显减弱ASS1敲除的促TNBC生长效应。ASS1通过促进PHGDH的泛素化降解抑制丝氨酸合成从而抑制TNBC的进展,进而发挥ASS1的抗肿瘤功能。我们的研究揭示了ASS1新的抗肿瘤机制,提示ASS1/PHGDH丝氨酸合成途径可能是肿瘤治疗的有前景的靶点。图40幅,表27个,参考文献368篇

摘要译文

关键词：

ASS1; PHGDH; 泛素化降解; 丝氨酸合成; 三阴性乳腺癌

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

罗志勇

中图分类号：

R737.9[乳腺肿瘤⑨]

学科分类号：

1002[临床医学]

D O I：

10.27661/d.cnki.gzhnu.2024.000166