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外周CD4+T细胞趋化入脑与小胶质细胞互作介导颞叶癫痫免疫炎症的机制研究认领

作者：

杨科

学位授予单位：

中南大学

摘要：

背景:颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）是最常见的成人局灶性癫痫,约1/3的TLE系药物难治性癫痫,挖掘新的药物治疗靶标是难治性颞叶癫痫治疗突破的关键。癫痫与免疫的关系近年来备受关注。免疫炎症的激活常加速并促进癫痫发生,而反复的痫性发作又常会导致致痫灶及远隔脑区的系列炎症,并对癫痫的预后产生影响。最新研究提示外周免疫炎症激活大脑中的常驻小胶质细胞可能是TLE发作的驱动因素,但其具体作用机制尚不清楚。因此,进一步深入挖掘癫痫疾病的外周-中枢免疫炎症互作机制,有助于阐明癫痫发生的异常免疫基础,从而为颞叶癫痫免疫炎症治疗提供特异的干预靶点。目的:从颞叶癫痫患者及颞叶癫痫动物模型两个层面揭示外周免疫细胞CD4+T细胞迁移入脑与中枢小胶质细胞存在相互作用,进而介导癫痫中枢免疫炎症的机制。深入挖掘外周CD4+T细胞趋化迁移和Th1/Th2分型极化的关键基因和可能的调控途径,探索其作为癫痫免疫炎症关键干预靶点的可行性,为耐药性癫痫的精准防治提供新思路。方法: 1.TLE外周血CD4+T细胞的Th1偏移和颞叶癫痫严重程度的相关性 1.1纳入27名难治性颞叶癫痫患者,收集癫痫患者临床资料,包括临床表现、脑电图及磁共振等。同时招募27名年龄、性别匹配的志愿者作为健康对照组,静脉收集外周血。 1.2构建氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,慢性自发痫性发作期收集外周血。 1.3免疫指标和血清神经丝蛋白（s NFL）测定:ELISA检测颞叶癫痫患者和动物模型血清细胞因子IL-1β,IL-6和IL-4,流式细胞仪检测CD4+T细胞的Th1（IFN-γ）和Th2（IL-4）亚型。提取PBMC通过q PCR检测血液的PBMC转录因子T-bet、GATA3。检测神经系统疾病的预后生物标志物s NFL,并将T-bet/GATA-3比值和s NFL进行相关性分析。 2.外周血CD4+T细胞迁移入脑调控中枢小胶质细胞炎症 2.1伊文思蓝评估慢性期颞叶癫痫动物模型血脑屏障的完整性,同时检测CD4+T细胞的迁移能力;免疫荧光观察大脑致痫灶海马和远隔皮层脑区CD4+T细胞和小胶质细胞的相对空间位置。 2.2构建慢性期氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型,尾静脉注射CD4+T细胞耗竭抗体,以及回输癫痫大鼠外周血CD4+T细胞后,检测对癫痫大鼠中枢小胶质细胞分型极化和炎症细胞因子分泌的影响。 3.探究介导外周CD4+T细胞迁移入脑激活中枢小胶质细胞炎症反应的信号通路 3.1对TLE患者的海马组织进行m RNA高通量测序,寻找颞叶癫痫患者致痫灶海马和健康对照的差异表达基因,并通过富集分析获得同时调控外周CD4+T极化和免疫细胞趋化入脑的关键基因。 3.2颞叶癫痫动物模型上验证调控该基因和相关信号通路将对颞叶癫痫大鼠外周CD4+T极化、CD4+T细胞趋化入脑和中枢小胶质细胞炎症产生的影响,同时完善癫痫大鼠视频脑电和行为学相关检测。结果: 1.与健康对照组相比,TLE患者和动物模型血清CD4+T细胞中Th1相关的促炎因子如干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的表达明显升高;而Th2相关抑炎细胞因子如白细胞介素（IL-4）和（IL-10）则显著降低。 2.与健康对照相比,TLE患者和动物模型血清神经丝轻链（s NFL）显著升高;外周血Th1/Th2 CD4+T细胞比例及T-bet/GATA3比值与s NFL水平显著相关。 3.在TLE大鼠致痫灶（海马）与远隔皮层,外周CD4+T细胞表达明显增加,且伴随有促炎因子INF-γ的表达上调和抑炎因子IL-4的表达下降。 4.与正常对照相比,TLE血脑屏障体外细胞模型中CD4+T细胞迁移率明显增加。在慢性期氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型的脑组织中,致痫灶海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达升高,而M2型小胶质细胞表达下降。 5.当外周CD4+T细胞被阻断耗竭,TLE大鼠海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达下降,而M2型小胶质细胞表达增高,同时伴随促炎因子INF-γ的分泌减少和抑炎因子IL-4的释放增加。 6.静脉回输自TLE大鼠提取的外周血CD4+T细胞后,实验大鼠致痫灶海马和远隔皮层M1型小胶质细胞表达增加,而M2型小胶质细胞表达减少,同时伴随促炎因子INF-γ的分泌增加和抑炎因子IL-4的释放减少。 7.对难治性TLE患者的手术切除海马组织行m RNA高通量测序,生物信息学分析筛选出可能同时参与CD4+T细胞Th1/Th2分化和趋化过程的关键基因通路——Notch 1信号通路。 8.在TLE大鼠模型中,腹腔注射DAPT抑制Notch 1降低了CD4+T细胞的中枢浸润,同时促进了外周和中枢神经系统CD4+T细胞向Th2亚型转化。此外,DAPT干预后中枢M1型小胶质细胞标志物（CD32、CD86）的表达显著下调,而M2型小胶质细胞标志物（CD163、CD200R）的表达则明显增加。 9.DAPT干预Notch 1信号通路显著降低TLE大鼠模型慢性期自发痫性发作次数,且显著提高了大鼠识别新物体和熟悉物体的能力。结论: 1.颞叶癫痫患者和慢性颞叶癫痫大鼠模型外周血均存在CD4+T细胞的激活,并显著向促炎Th1型转变,且与神经元损害程度相关,提示外周血Th1 CD4+T细胞可能参与并影响颞叶癫痫的病理生理过程和疾病进展。 2.颞叶癫痫大鼠模型致痫灶海马和远隔皮层脑区CD4+T细胞浸润明显增加,且向Th1极化;CD4+T细胞与中枢小胶质细胞在空间位置上毗邻;致痫灶海马和远隔皮层脑区的小胶质细胞活化并向M1极化,推测颞叶癫痫外周CD4+T细胞可趋化入脑,通过调节中枢M1型小胶质细胞促炎反应介导癫痫炎症反应。 3.Notch 1可能是调节外周血CD4+T细胞趋化入脑、介导中枢小胶质细胞炎症的关键基因。γ分泌酶抑制剂DAPT选择性抑制Notch1,可降低外周血CD4+T细胞趋化入脑、减轻小胶质细胞炎症反应和神经元损伤,减少癫痫发作频率并改善记忆等认知功能。图14幅,表5个,参考文献154篇

摘要译文

关键词：

颞叶癫痫; CD4+T细胞; 小胶质细胞; 互作; 免疫炎症

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

临床医学（专业学位）

导师：

肖波

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27661/d.cnki.gzhnu.2024.000498