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生防产酶溶杆菌中新型群体感应淬灭蛋白的鉴定及作用机制研究认领

作者：

廖金星

学位授予单位：

南京农业大学

摘要：

群体感应(quorum sensing,QS)是一种由自身产生的小分子化合物介导的微生物通讯系统,它参与调控许多动植物病原细菌的致病过程,其中以酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones,AHLs)介导的群体感应系统研究最为深入。群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)是指通过干扰或阻断群体感应系统的正常通讯从而降低植物病原菌毒力的一种有效手段。目前从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等生防细菌中鉴定出许多经典的群体感应淬灭酶,这些经典的群体感应淬灭酶不需要进入到病原细菌中,可以通过直接降解环境周围的群体感应信号分子来实现群体淬灭达到防控病害的目的。产酶溶杆菌OH11(Lysobacter enzymogenes OH11)是一株分离于辣椒根际土壤的革兰氏阴性生防细菌,它对许多病原真菌、卵菌引起的植物病害具有很好的防控作用,其中次生代谢产物HSAF(Heat-stable antifungal factor,HSAF)是主要的生防因子,然而目前对革兰氏阴性细菌的生物防治研究较少。产酶溶杆菌OH11不能直接降解AHL,但是它能通过Ⅳ型分泌系统向病原细菌体内注射Ⅳ型效应蛋白来抑制病原菌生长从而发挥生防效果。本研究以产酶溶杆菌OH11为研究材料,进一步探索了Ⅳ型效应蛋白是否可以作为一种天然的群体感应淬灭蛋白进入到受体菌体内,从源头上减少群体感应信号分子的产生从而实现种间群体淬灭。通过挖掘与鉴定新型的群体感应淬灭蛋白可为群体感应淬灭剂的开发和应用提供新材料,为植物病害的生物防治提供理论基础和基因资源。具体研究结果如下: (1)Ⅳ型效应蛋白LqqE1是一种产酶溶杆菌向病原细菌自然转运的“非经典”群体感应淬灭蛋白:实验室前期研究发现,产酶溶杆菌OH11基因组中编码了16个预测的Ⅳ型效应蛋白,本研究成功将其中13个Ⅳ型效应基因表达于具有典型AHL合成酶的荧光假单胞(Pseudomonas fluorescens)2P24中并检测对其AHL产量的影响。其中发现Le1288的表达能够显著抑制2P24中AHL的产生,并且对与OH11同生态位的假单胞菌A8(Pseudomonas chlororaphis)具有相同的AHL淬灭效果。因此本研究将Le1288定义为LqqE1(Lysobacter quorum-quenching effector 1)。进一步以OH11-2P24为工作模型证明了产酶溶杆菌OH11能通过Ⅳ型分泌系统将LqqE1直接转运到2P24的细胞质中,LqqE1不同于经典的群体感应淬灭酶,它不能直接降解AHL信号分子,而是通过与AHL合成酶Pco I相互作用,并进一步干扰Pco I与AHL合成底物SAM的结合来抑制AHL的产生。其中第68位的谷氨酸和第126位的丝氨酸对于LqqE1发挥AHL淬灭效果至关重要。接下来本研究以人类条件致病菌铜绿假单胞PAO1(Pseudomonas aeruginosa)以及植物病原菌青枯雷尔氏菌EP1(Ralstonia solanacearum EP1)为例,进一步证明了LqqE1在控制细菌毒力方面的潜力。研究发现LqqE1同样可以通过与PAO1中AHL合成酶Rhl I直接相互作用来抑制AHL的产生,并显著降低了Rhl I群体感应系统调控的毒力因子绿脓菌素以及鼠李糖脂的产生。同时,研究发现LqqE1也可以通过与EP1中AHL合成酶Ras I直接相互作用来抑制AHL的产生,并显著抑制了Ras I群体感应系统调控的swimming能力。 (2)LqqP1和LqqP2是产酶溶杆菌中新发现的“非经典”群体感应淬灭蛋白:为了进一步鉴定在OH11中其他的非经典群体感应淬灭蛋白。本研究以荧光假单胞2P24(P.fluorescens 2P24)中典型的AHL合成酶Pco I为诱饵靶标,建立了一个通过蛋白-蛋白互作直接“钓取”产酶溶杆菌OH11基因组中具有AHL淬灭效果蛋白的实验系统。通过该系统在产酶溶杆菌OH11中找到了一个基因Le0959,它在荧光假单胞2P24中的表达显著抑制了AHL的产生。因此,本研究将Le0959定义为LqqP1(Lysobacter quorum-quenching protein 1)。研究发现LqqP1同样不同于经典的群体感应淬灭酶,它通过直接与AHL合成酶相互作用,并减少体内AHL合成酶的蛋白丰度来抑制AHL的产生,其中第78位半胱氨酸对于LqqP1结合Pco I并抑制AHL的产生具有至关重要的作用。同时,研究发现LqqP1也能通过靶向铜绿假单胞菌PAO1(P.aeruginosa PAO1)中AHL合成酶Rhl I来减少Rhl I依赖的AHL产生,并且显著降低了Rhl I群体感应系统调控的毒力因子绿脓菌素、鼠李糖脂的产生以及运动性能力。本研究还发现LqqP1在产酶溶杆菌中不仅能够正调控生物膜的形成,而且还负调控抗真菌次生代谢产物HSAF的产生。同时,产酶溶杆菌能将LqqP1外泌至胞外。此外,本研究还通过建立一个涉及比较基因组学、遗传筛选和生化研究的实验系统,在产酶溶杆菌OH11中鉴定到了另一个新型的AHL群体淬灭蛋白LqqP2。研究发现LqqP2也不同于经典的AHL降解酶,它能通过与多种AHL合成酶直接相互作用来抑制AHL的产生,其中包括来自荧光假单胞2P24(P.fluorescens 2P24)的Pco I、软腐果胶杆菌PccS1(Pectobacterium carotovorum PccS1)的Car I和变棕溶杆菌OH21(Lysobacter brunescenns OH21)的Lbs I。进一步研究发现LqqP2通过蛋白-蛋白相互作用减少了AHL合成酶Car I的蛋白丰度从而抑制了其AHL的产生,并且在PccS1中表达lqqP2显著降低了多种毒力相关的胞外酶产生,同时也显著影响了对大白菜的侵染能力。此外,第70位和第84位的精氨酸对于LqqP2发挥AHL淬灭作用至关重要。综上所述,本研究表明产酶溶杆菌OH11中Ⅳ型效应蛋白LqqE1可以作为一种天然的非经典AHL群体感应淬灭蛋白,并证明了LqqE1在防控植物病害方面的生防潜能。此外,本研究还通过蛋白-蛋白互作、比较基因组学等方法鉴定了另外两种非经典的新型群体感应淬灭蛋白LqqP1与LqqP2。总而言之,本研究的发现可以为利用群体感应淬灭手段防控病害提供新材料和新思路。

摘要译文

关键词：

产酶溶杆菌; 群体感应(QS); 酰基高丝氨酸内酯(AHLs); 群体感应淬灭(QQ); Ⅳ型分泌系统(T4SS)

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

植物病理学

导师：

钱国良

中图分类号：

S476[生物防治]

学科分类号：

090402[昆虫学];090904[草地保护学]

D O I：

10.27244/d.cnki.gnjnu.2023.000105