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海洋源酵母Scheffersomyces spartinae W9及其挥发性组分2-苯乙醇对草莓采后灰霉病的防治机制认领

作者：

邹秀容

学位授予单位：

宁波大学

摘要：

草莓（Fragaria ananassa Duch.）果实营养丰富,味道鲜美,广受消费者喜爱,在我国和世界范围内广泛种植。然而,采后草莓果实极容易受病原菌侵染,其中由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）侵染导致的灰霉病是造成草莓采后损失的重要病害。拮抗酵母对多种果蔬的采后病害有良好防治效果,利用拮抗酵母进行生物防治被认为是减少或替代使用化学防治的绿色防控技术。然而拮抗酵母在商业化应用时却常表现出防治效果远低于实验室水平,影响了拮抗酵母的应用和推广。造成这种现象的其中一个重要原因是拮抗酵母在田间或采后贮运过程中遭受各种生物和非生物胁迫,致使其存活力差而影响生防效果。因此,对不良环境的抗逆性是拮抗酵母发挥生防作用必不可少的。海洋环境具有高盐、高压、低温、贫营养的特点,其独特的生态条件使海洋微生物大多具有对不良环境的抗逆性,因此海洋是分离筛选高抗逆性酵母的良好来源。本研究从海洋热带岛屿潮间带沉积物中分离、鉴定和筛选对草莓灰霉病具有良好控制效果的高抗逆性酵母,研究拮抗酵母Scheffersomyces spartinae W9控制草莓灰霉病的机理及酵母主要挥发性组分2-苯乙醇（2-phenylethanol,2-PE）对B.cinerea的抑菌机制,并初步解析2-PE对酵母种群密度的调控作用和调控机理。本研究为海洋微生物资源开发及其在农业病害的防控应用研究提供借鉴;也为拮抗酵母生防机制解析,尤其是挥发性物质的抑菌作用及群体感应调控拮抗酵母的生防效果提供理论基础。主要研究结果如下: 1.基于高通量扩增子测序,从南海热带岛屿潮间带沉积物中鉴定出子囊菌门和担子菌门的14个酵母属,其中Candida为优势属。通过人工培养获得22株分离株,其中18株酵母和一株酵母样真菌对B.cinerea表现较强的体外抑菌活性。S.spartinae W9能够在体内外抑制B.cinerea孢子萌发,显著降低草莓灰霉病的发病率和病斑直径,且不影响果实感官品质。此外,S.spartinae能在p H 2.5～10范围生长,对高盐、高温、氧化胁迫、紫外辐照具有较强的抗逆性,急性经口毒性试验证实该酵母为实际无毒级别。 2.常温贮藏条件下,S.spartinae W9在草莓表面和伤口处都能实现快速增殖,而在低温长时间的贮藏条件下,酵母增殖速度很慢,数量基本保持不变。S.spartinae W9具有较强的生物被膜能力。S.spartinae W9可生成β-1,3-葡聚糖酶,但不能产生几丁质酶、蛋白酶和纤维素酶,可粘附到灰霉菌丝,但没有寄生作用。推测S.spartinae W9的快速增殖能力和生物被膜能力是其控制草莓采后灰霉病的重要作用机制。 3.S.spartinae W9产生的挥发性物质（volatile organic compounds,VOCs）能够抑制B.cinerea菌丝生长和孢子萌发,降低草莓灰霉病的发病率和病斑直径。经电子显微镜观察发现VOCs能使B.cinerea的菌丝形态和超微结构发生损伤。顶空固相微萃取和气相色谱-质谱联用技术分析S.spartinae W9产生18种主要的VOCs。经体外试验证实VOCs中的3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇、2-PE和乙酸异戊酯都能抑制B.cinerea菌丝生长,其中2-PE的抑制效果最好。可见,产生抑菌性的VOCs是S.spartinae W9防控草莓灰霉病的另一重要机制。 4.2-PE对B.cinerea菌丝生长的最小抑制浓度为1.0 mL L-1。2-PE可抑制草霉灰霉病,且不影响果实的感官品质。扫描电镜和透射电镜观察显示,2-PE可破坏B.cinerea菌丝的外部形态和超微结构。RNA测序分析发现,2-PE胁迫导致B.cinerea中2755个基因发生差异表达。其中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的编码基因,及硫代谢和谷胱甘肽代谢途径上调,表明2-PE导致B.cinerea发生活性氧（reactive oxygen species,ROS）胁迫。这个结果与2-PE处理后,B.cinerea细胞中的ROS和过氧化氢含量上升,CAT、SOD和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的酶活增加,及丙二醛含量增加相一致。在2-PE胁迫下,B.cinerea细胞膜相关基因的表达发生显著改变:ABC膜转运蛋白基因表达上调,MFS膜转运蛋白基因表达下调,麦角甾醇生物合成基因表达下调,这与细胞膜完整性受损、脂质发生过氧化的结果一致。因此,2-PE对B.cinerea的主要抑菌机制是氧化胁迫和细胞膜损伤。 5.S.spartinae W9的2-PE生成量,及2-PE的合成关键基因ARO9、ARO10与其种群密度呈正相关。生理浓度下的外源2-PE对酵母生物被膜形成无影响,但能够促进S.spartinae W9在体外和草莓伤口处的生长。2-PE是S.spartinae W9的群体感应分子。转录组测序分析发现2-PE影响S.spartinae W9的多个代谢通路,其中酵母减数分裂通路和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路发生上调。2-PE可能通过激活MAPK信号通路下游与细胞增殖相关蛋白编码基因GRE2、MSN4和CDC25的表达,从而促进酵母的生长。

摘要译文

关键词：

草莓; 生物防治; Botrytis cinerea; 拮抗酵母; 2-苯乙醇; 群体感应

学位年度：

2023

学位类型：

博士

学科专业：

水产资源综合利用

导师：

邵兴锋

中图分类号：

S436.68[多年生草本果类病虫害];S476[生物防治]

学科分类号：

090401[植物病理学];090402[昆虫学];090904[草地保护学]

D O I：

10.27256/d.cnki.gnbou.2023.002204