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大灰藓次生代谢产物、内生菌的多样性及其气候地理因素研究认领

作者：

王瑶

学位授予单位：

上海师范大学

摘要：

大灰藓(Calohypnum plumiforme（Wilson）Jan Ku（?）era&Ignatov)隶属于藓类植物门（Bryophyta）灰藓科（Hypanaceae）,是东亚地区广泛分布的一种侧蒴藓类植物。该种植物往往能够形成单优势种群的成片藓丛,且很少被病原菌侵染,这一现象暗示其体内可能存在某些抗逆成分和机制。虽然关于大灰藓的次生代谢产物有零星报道,但是取样范围有限,报道的化合物种类不多。苔藓植物的内生菌参与了多种次生代谢产物的形成,但是关于大灰藓内生菌方面的研究十分有限。目前尚不清楚大灰藓提取物的生物活性及其活性成分、挥发性化学成分和内生菌多样性情况及其两者关系,以及气候与地理因素对大灰藓内生菌和次生代谢产物的影响情况。稻壳酮是一种有化学他感和抑菌活性的二萜类化合物,目前仅在水稻和大灰藓中被发现。鉴于大灰藓和水稻巨大的系统发育差异,这种现象是否是由于稻壳酮检测的取样范围不够所导致?不同地理点大灰藓稻壳酮含量差异如何?另外,调控稻壳酮生物合成的转录因子也并不清楚。围绕以上科学问题,本研究从浙江、湖南、贵州17个不同地理点采集了大灰藓样品,获得了不同溶剂的提取液,测定了它们的生物活性,应用液质联用技术进一步鉴定了可能的活性成分;然后基于气质联用技术测定了不同地理点大灰藓样品的挥发性化学成分,基于扩增子测序技术检测定了不同地理点大灰藓内生细菌和真菌的多样性,同时分析了大灰藓挥发性化学成分与内生菌之间的相关性,以及气候地理因素对大灰藓内生菌和挥发性化学成分的影响;同时对采自浙江西天目山、古田山、钱江源、凤阳山和顺溪坞的大灰藓等47种苔藓植物进行了稻壳酮含量的测定,最后对大灰藓中稻壳酮生物合成相关的WRKY转录因子开展了全基因组鉴定与比较分析。主要内容和结果如下: 1.检测了17个地理来源大灰藓样品水、石油醚和乙酸乙酯提取液对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率。采自浙江淳安千岛湖地区龙山岛、78号岛、103号岛、贵州安顺杨家庄、浙江象山狮子山5个地理点的大灰藓提取液具有良好的抗氧化活性,对DPPH自由基和ABTS+自由基的清除率分别在48.00-84.29%和39.95-89.55%之间。龙山岛和78号岛的大灰藓乙酸乙酯提取液能够将A549肺癌细胞存活率分别下降至70.08%和65.85%。 2.借助高分辨四级杆飞行时间串联液质联用仪（UPLC-Q-TOF/MS）,检测了不同地理来源大灰藓水相、石油醚相和乙酸乙酯相的化学成分,共检测到47种次生代谢产物,分别是槲皮素、南方贝壳杉、双黄酮、千层纸素A、福橘素、山姜素、粘毛黄芩素Ⅰ、扁柏双黄酮、刺槐素、白果黄酮、异泽兰黄素、草果素、4′,7-二甲基鸢尾黄素、桑皮酮S、柚木杨素、穗花杉双黄酮、金钱松双黄酮、石吊兰素、5,6,7,3′-四羟基-4′-甲氧基异黄酮、泽兰黄醇、白射干素、麻黄宁F、（-）-龙脑阿魏酸酯、异樱花素、表-β-檀香烯、3-羟基黄芩素、苏铁双黄酮、洋地黄内酯、6-羟基山柰酚、5-羟基酸橙素、甜橙素、苦参色满黄酮C、异柳杉素、鼠李秦素、1,3-二羟基-2-甲氧基讪酮、原矢车菊素A2、异鼠李素、2-大茴香酯基-5-甲基-1-己烯、α-水芹烯、桑根素I、田蓟苷、Cnidimol A、1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘、反式-2-甲氧基肉桂醛、野黄芩苷元、亥茅酚和川陈皮素。以上这些次生代谢产物以黄酮类为主,并有少量萜类;分布最广的是桑根素I和1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘,其次为山姜素、洋地黄内酯和异柳杉素。大灰藓对自由基的清除能力以及对肺癌细胞的抑制能力可能与上述化合物中的黄酮类和萜类化合物有关;1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘在大灰藓中的广泛分布,说明大灰藓在吸附空气化学污染物上有重要作用。 3.借助气相色谱-离子迁移谱联用仪（GC-IMS）,对17个地理来源大灰藓样品的特征挥发性化学成分进行了检测,共检测出169个信号,鉴定出挥发性成分148个,匹配117个挥发性化合物。这些化合物包括了醛类（30种）、醇类（24种）、酯类（20种）、酮类（14种）、萜类（12种）、呋喃类（4种）、吡嗪类（3种）,苯、噻吩和醚类化合物均仅有1种。 4.气候地理因素强烈地影响大灰藓挥发性化学成分组成。不同地理来源的大灰藓样品,挥发性成分存在明显差异。13个生物气候变量条件共解释了17个地理点大灰藓化学成分90.3%的变量,说明大灰藓的化学成分受到气候的强烈影响。基于冗余分析,在13个生物气候变量因子中,以雨量变化方差的影响最大,其次是最冷季度平均温度、最干季节平均温度,最暖季节平均降雨量也有一定影响。方差分解表明,七个温度因子对大灰藓挥发性化学成分的综合影响总体上大于六个雨量因子的影响,气候的因素远远大于单纯地理位置间的变异。匹配的化合物中,γ-丁内酯,苯甲酸甲酯,乙酸、3-甲基-1-丁醇和噻吩受气候和地理因素的影响最为显著。随着温度的上升,大灰藓挥发性化学成分的丰度也在增加。 5.对采自浙江淳安千岛湖地区、贵州安顺杨家庄、浙江象山高塘岛狮子山、贵阳百花湖和浙江临安清凉峰的大灰藓样品进行了内生菌扩增和测序。通过总DNA提取、PCR扩增、PE文库构建和Illumina测序,结合ASVs分类学注释、物种多样性及功能预测,从样品中共检测出了108种内生细菌和78种内生真菌。鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、丛毛单胞菌科（Comamonadaceae）、小单孢菌科（Micromonosporaceae）和分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）分支杆菌属（Mycobacterium）是大灰藓最主要的内生细菌;瘦脐菇属（Rickenella）、Trichomeriaceae和Knufia是大灰藓中比较常见的内生真菌。内生真菌群落的物种多样性和群落结构在不同地理样本之间的差异要大于内生细菌群落。随着大灰藓内生菌丰富度的增加,多样性指数上升,但是总的丰度和优势度指数显著下降,在内生真菌和内生细菌中均呈现相同的变化趋势。这表明大灰藓对菌株的定殖具有选择作用,如果有某些显著优势的内生菌,则会抑制其他内生菌的发生,表现出优势度上升,但是多样性下降,一定程度上反映了优势内生菌对其他内生菌的某种竞争关系。在合计5832对内生细菌类群的关系中,仅有517对关系达到了显著或极显著的关系,占总的关系对数量的8.9%,反映这部分内生菌在发生上有密切的关系;这一现象在大灰藓的内生真菌类群间也有同样的表现。同时,在有显著关系的内生菌类群间,大部分显示出正相关关系,一定程度上说明了大部分内生菌间并无竞争抑制关系,它们可能在大灰藓占据着互补的生态位。 6.气候地理因素会显著影响大灰藓内生菌的丰度和组成。大灰藓内生菌群落组成受地理位置的显著影响（P<0.02）;内生细菌的Shannon多样性指数随着纬度增加而下降（Pearson相关系数=-0.693,P=0.084）。最冷季度平均温度对内生细菌类群丰富度的影响最为显著,其次是年温度变异范围对内生细菌Shannon多样性的影响。有相当一部分内生细菌在大灰藓内的分布受到气候因素的影响,但是气候因素对大灰藓不同内生细菌类群丰度的作用性质和程度存在很大差异。冗余分析表明,13个气候变量对78个内生真菌类群丰度有显著的影响。最冷季度平均温度、最冷季度平均雨量、年平均温度、最干季度平均雨量、年温度变化范围和最暖季度平均温度是影响大灰藓内生真菌丰度的六个主要气候因素。 7.构建了7个地理点大灰藓挥发性化学成分指纹图谱并进行内生菌的关联分析。借助GC-IMS构建挥发性化学成分指纹图谱,进一步通过Pearson相关分析及Student’s t test在显著性水平为0.05的条件下进行检验,发现了15种特征挥发性化合物,包括2,5-二甲基吡嗪、2-正戊基呋喃、γ-松油烯、2-甲基-2-戊烯醛、2,3-二甲基吡嗪、乙酸戊酯、反式-2-己烯-1-醇、乙酸丙酯、E-2-辛烯醛、3-甲基-3-丁烯-1-醇、四氢呋喃、反式-2-辛烯-1-醇、异薄荷酮、丁酸乙酯、萜品油烯。这些特征化合物为鉴别大灰藓样品的地理来源提供了基础。大灰藓的挥发性化合物受到内生菌不同程度的影响。在148种挥发性化合物中,有123种化合物的含量受到了至少一种内生真菌的影响;有超过13类挥发性化合物,每一类至少受10种以上的内生真菌的影响。在受内生细菌显著影响的大灰藓116类挥发性化合物中,有67类的含量受到1至5种内生细菌的显著影响。有超过20类挥发性化合物的含量,每一类至少受到10种以上的内生细菌的显著影响。 8.在产自浙江和贵州不同地区的55份苔藓植物样品中,有19份样品中检测到稻壳酮成分,含量（μg/g）最高的是采自浙江临安的大灰藓（71.75）,其次为采自浙江钱江源的灰藓凹叶变种（Hypnum cupressiforme var.lacunosum）(57.17)和浙江淳安千岛湖的两份大灰藓样品（分别为25.024和9.362）。本研究首次从大羽藓（Thuidium cymbifolium）、大桧藓（Pyrrhobryum dozyanum）、东亚小金发藓（Pogonatum inflexum）、灰藓凹叶变种、节茎曲柄藓（Campylopus umbellatus）、绿色白发藓（Leucobryum chlorophyllosum）、拟梳灰藓（Hypnum submolluscum）、长喙灰藓（Hypnum fujiyamae）、直叶灰藓（Hypnum vaucheri）、直叶棉藓短尖变种（Plagiothecium euryphyllum var.brevirameum）和鞭苔（Bazzania trilobata）中检测到了稻壳酮的分布,含量（μg/g）在0.265至5.53之间,这是首次从大灰藓和水稻以外的植物中检测到了稻壳酮;稻壳酮的含量不仅在不同的苔藓植物中,而且在同一种苔藓植物的不同种群中,都存在着显著的差异。 9.开展了大灰藓中稻壳酮生物合成相关WRKY转录因子的全基因组鉴定与比较分析。借助基因鉴定、多序列比对、系统进化分析、基因结构和基序组成分析及启动子顺式作用元件分析等方法,从大灰藓中共鉴定出19个CpWRKY基因,根据其系统发育关系将其分为5个亚组;保守结构域和基序分析表明,WRKY结构域高度保守,但存在一定的变异;顺式作用元件和结合位点分析表明,CpWRKY基因可能受到胁迫诱导,进而调控稻壳酮的生物合成。以上研究表明,大灰藓有丰富的内生菌和次生代谢产物。通过黄酮等次生代谢产物清除自由基、通过稻壳酮的化感作用抑制杂草的生长可能是其广泛而成片分布的内在机制之一;对1,1,6-三甲基-1,2-二氢萘的吸收说明大灰藓在吸附空气化学污染物上有重要作用;大灰藓的挥发性化学成分和内生菌受到气候地理因素的强烈影响,随着温度的上升会使大灰藓挥发性化学成分增加;大灰藓中含有丰富的内生菌资源,相当一部分内生菌会明显影响次生代谢产物的含量;内生菌中的部分优势种会抑制其他内生菌的生长与定殖,但是总体而言,大部分内生菌之间并无竞争抑制关系,可能在大灰藓内部占据着互补的生态位。稻壳酮不局限分布于水稻和大灰藓中,可能是一些苔藓植物抵御病原菌侵染、抑制杂草生长的机制之一;大灰藓中的CpWRKY基因可能调控着稻壳酮的生物合成。上述研究结果,加深了人们对大灰藓适应环境的生物学机制、药物开发价值和稻壳酮生物合成机制等方面的认识,表明全球气候变化可能会通过影响苔藓植物内生菌活动、增加挥发性化学成分的释放而影响地球生态系统。因此,本研究具有一定的理论和实践指导意义。

摘要译文

关键词：

大灰藓; 次生代谢产物; 内生菌; 环境因素; 人肺癌细胞; WRKY转录因子

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

环境科学与工程

导师：

郭水良

中图分类号：

Q948[植物生态学和植物地理学]

学科分类号：

071002[植物学];071301[植物生态学]

D O I：

10.27312/d.cnki.gshsu.2024.002529