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短暂性脑缺血诱导的代谢谱变化及其通过中性粒细胞介导神经保护的作用与机制研究认领

作者：

刘容容

学位授予单位：

暨南大学

摘要：

第一部分短暂性脑缺血发作患者代谢组学研究背景和目的短暂性脑缺血发作(Transient ischemic attacks,TIA)被认为是发生缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke,CIS)的先兆。约50%TIA患者在发病后48h内可继发CIS。也有临床研究证实:TIA可诱导缺血耐受,对继发的CIS具有神经保护作用,但TIA如何诱导缺血耐受,进而产生神经保护作用的机制目前尚不明确。血液中代谢物与脑血管疾病的发生发展有关,但TIA后外周血代谢谱的变化规律及其在继发CIS患者神经功能恢复中的作用目前尚不清楚。本研究拟利用代谢组学研究观察TIA患者发病后不同时间点的外周血代谢谱变化,旨在筛查出与脑缺血预处理(ischemic preconditioning,IPC)相关的代谢物,并为后续探索其在CIS中的作用奠定基础。方法收集20例TIA患者发病后1d和7d外周静脉血,经离心后分离出血浆,利用液相色谱-质谱联用技术(Liquid chromatography with Mass Spectrometry,LC-MC/MS)检测代谢谱的表达情况。采用偏最小二乘判别分析法(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)分析TIA患者发病后7d和1d的代谢模式差异,并通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)、人类代谢组数据库(Human metabolome database,HMDB)和脂质代谢途径研究(Lipid metabolites and pathways strategy,LIPID MAPS)等数据库进行代谢物通路及分类注释以解释代谢物相关的生物学意义并筛选出差异代谢物,采用KEGG富集通路分析找出差异高表达代谢物富集的代谢途径,利用标准分数(Z-score)衡量同一水平代谢物的相对含量的高低。结果 1.TIA患者血浆代谢物LC-MC/MS结果:总共检测到1543种代谢物质,其中正离子模式966种,负离子模式577种。 2.PLS-DA分析结果:正离子和负离子模式下2个时间点差异代谢物的Q2值>0.8,且R2Y>Q2Y,R2值>Q2值且Q2回归线与Y轴的截距<0,提示纳入的TIA病例样本具有代表性,并可作为模型生物标记物寻找的前提。 3.KEGG通路注释结果:TIA患者检出的血浆代谢物主要参与脂类新陈代谢信号通路,其中与神经系统疾病有关的有14种,而与免疫系统相关的有4种。 4.HMDB分类注释结果:TIA患者发病后血浆代谢物最主要参与脂质和类脂分子的代谢途径。 5.LIPID MAPS分类注释结果:TIA患者发病后血浆代谢物最主要注释到脂肪酸类。 6.与TIA发病后1d相比,发病后7d的血浆中有151种差异表达的代谢物,其中85种差异高表达,另66种为差异低表达(P<0.05)。 7.KEGG通路富集分析显示:85种差异高表达代谢物主要富集于视黄醇(全反式13,14二氢视黄醇)和花生四烯酸(20-羧基白三烯B4和前列腺素B2)代谢通路及神经组织激活配体-受体相互作用通路(皮质醇);而66种差异低表达的代谢物主要富集在磷酸盐和苯丙氨酸代谢通路(丙酮酸、苯丙氨酸、水杨酸、苯乙醛)。 8.Z-score分析显示:TIA发病后7d,在同一水平9-氧代-10(E),12(Z)-十八碳二烯酸(9-Oxo-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid,9-KODE)的含量是明显增高的(P<0.05)。 9.综合TIA患者发病后血浆代谢物的分类注释和KEGG通路富集分析结果发现差异高表达的代谢物中属于内源性的代谢物,其中前列腺素B2和20羧基-白三烯B4参与脂肪酸类物质代谢且又富集于KEGG最显著富集通路上。结论 1.TIA患者发病后血浆代谢谱有明显变化,发病后7d与1d相比差异表达代谢物主要参与脂类和和类脂分子的代谢途径。 2.TIA患者血浆中皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4和前列腺素B2含量显著增加,主要富集于视黄醇和花生四烯酸代谢通路。第二部分短暂性脑缺血诱导的差异代谢物对缺血性脑卒中的作用背景和目的急性CIS目前最为有效的治疗方法是早期血管再通治疗,但受严格时间窗等条件限制,以及继发性出血等并发症影响,真正能从早期血管再通治疗中获益的CIS患者目前国内不到10%。造成此现象的主要原因之一是对CIS的发病机制缺乏深入了解。因此,通过探索CIS发病机制寻求更多有效治疗方案是很有必要的。 TIA可能对继发CIS患者产生IPC作用。IPC是一种内源性保护机制,具有显著的神经保护作用。既往IPC神经保护作用的研究主要集中在体液和神经因子相互作用过程。最新研究提示IPC诱导代谢谱的变化在缺血耐受中具有重要作用,但TIA诱导的血浆代谢物变化在CIS中的作用目前尚不清楚。本研究在第一部分的研究基础上,我们进一步观察TIA患者差异高表达代谢物在实验性CIS模型中是否具有神经保护作用。方法 1.观察药物预处理对神经功能的影响线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,动物随机分为Sham组、Vehicle+MCAO组和药物预处理+MCAO组,每组8只。造模前第5d开始药物预处理组分别给予腹腔注射皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2,每天一次,连续5d。术后2d采用mNSS评分,滚筒、粘贴物去除和悬挂试验进行神经功能评分;利用Nissl染色计算脑梗死体积;原位末端标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)法观察脑梗死周边区细胞凋亡情况;免疫印迹法(Western blot,WB)检测脑梗死周边区凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。 2.观察药物后处理对神经功能的影响线栓法制备小鼠MCAO模型,动物随机分为Sham组、MCAO+Vehicle组和MCAO+药物后处理组,每组8只。药物后处理组术后2h分别给予腹腔注射皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2,每天一次,共3次。术后2d采用mNSS评分,滚筒、粘贴物去除和悬挂试验进行神经功能评分;利用Nissl染色计算脑梗死体积;TUNEL法观察脑梗死周边区细胞凋亡情况;WB检测脑梗死周边区凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果 1.与Vehicle+MCAO组相比,药物预处理组(包括皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2)小鼠MCAO后2d的神经功能显著改善;Nissl染色结果显示全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE预处理组小鼠MCAO后2d的脑梗死体积显著减小;TUNEL染色显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE预处理组小鼠脑梗死周边区的凋亡细胞显著减少;WB结果显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE预处理组脑梗死周边区Bcl-2的表达显著增高,Bcl-2/Bax的比值亦显著增加(P均<0.05)。 2.与MCAO+Vehicle组相比,药物后处理组(包括全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4或前列腺素B2)小鼠MCAO后2d的神经功能显著改善;Nissl染色结果显示全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE后处理组小鼠MCAO后2d的脑梗死体积显著减小;TUNEL染色显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE后处理组小鼠脑梗死周边区的凋亡细胞显著减少;WB结果显示全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE后处理组脑梗死周边区Bcl-2的表达显著增高,Bcl-2/Bax的比值亦显著增加(P<均0.05)。结论 TIA诱导的血浆差异高表达代谢物皮质醇、全反式13,14二氢视黄醇、9-KODE、20-羧基白三烯B4和前列腺素B2均能显著改善MCAO小鼠神经功能缺损,其中全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE有更明显的神经保护作用,可缩小脑梗死体积,减少脑细胞凋亡。第三部分全反式13,14二氢视黄醇通过中性粒细胞FoxO信号通路介导神经保护的作用与机制研究背景和目的脑缺血损伤后中性粒细胞是最先产生反应的免疫细胞。中性粒细胞在缺血性脑血管疾病中具有“双刃剑”作用。有些代谢物可抑制中性粒细胞迁移、脱粒以及白三烯的合成,从而通过抗炎发挥神经保护作用。本研究我们拟观察TIA患者发病后不同时间点外周血中性粒细胞数和中性粒性粒细胞基因表达变化,并将血浆中差异高表达全反式13,14二氢视黄醇的相对定量结果与其进行相关分析,旨在探索中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇介导的神经保护中的作用。方法 1.收集17例TIA患者发病后1d和7d的外周静脉血进行血常规检测,对比分析白细胞数、中性粒细胞数以及单个核细胞数变化;对中性粒细胞进行mRNA二代测序,并进行KEGG通路富集分析。 2.分别将TIA患者血浆差异高表达代谢物(全反式13,14二氢视黄醇和9-KODE)的相对定量结果与白细胞数、中性粒细胞数和单个核细胞数或二代测序结果进行皮尔逊相关分析。 3.为了验证中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇介导的神经保护中的作用,利用抗Ly6G抗体腹腔注射消耗中性粒细胞。将动物随机分为3组:Vehicle+MCAO组,Anti-Ly6G+MCAO 组,全反式 13,14 二氢视黄醇+Anti-Ly6G+MCAO 组,每组8只。术后2d进行神经功能评分(同第二部分)并采用Nissl染色计算脑梗死体积。结果 1.17例TIA患者发病后7d和1d的血常规对比分析结果:10例TIA患者白细胞计数和中性粒细胞计数是轻度增高的,9例TIA患者单个核细胞计数轻度增高。中性粒细胞mRNA二代测序结果:与TIA发病后1d相比,7d外周血中性粒细胞中有300种差异表达基因,其中121种表达下调,179种表达上调(P均<0.05);KEGG通路富集分析显示FoxO信号通路是TIA发病后差异表达基因最显著富集通路之一。 2.皮尔逊相关分析显示TIA患者血浆全反式13,14二氢视黄醇高表达水平与外周血白细胞和中性粒细胞计数增加均呈显著正相关(P均<0.05);且与中性粒细胞多个差异表达呈显著正相关(P均<0.05),包括鸟氨酸脱羧酶抗酶3蛋白(OAZ3),转膜蛋白67(TMEM67)、长基因间非蛋白编码RNA 1560(LINC01560)和蛋白质酪氨酸磷酸酶(AC034105.3)等。3.与Anti-Ly6G+MCAO组相比,全反式13,14二氢视黄醇预处理组小鼠MCAO后2d的神经功能未见显著改善,脑梗死体积未见明显减小(P>0.05)。结论TIA患者血浆全反式13,14二氢视黄醇水平的增加与外周血中性粒细胞增多明显相关;中性粒细胞在全反式13,14二氢视黄醇对MCAO小鼠神经保护功能中起重要作用,并可能通过参与FoxO信号通路发挥作用。

摘要译文

关键词：

短暂性脑缺血发作; 代谢谱; 血浆; 缺血预处理; 大脑中动脉闭塞; 9-KODE; 全反式13,14二氢视黄醇; 缺血耐受; 小鼠; 短暂性脑缺血发作; 中性粒细胞; 二代测序; 神经保护; FoxO信号通路

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

张玉生曾智军

中图分类号：

R743.31[短暂性脑缺血⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27167/d.cnki.gjinu.2022.002812