基于SSCs/OCs探讨木豆异黄酮预防骨质疏松症形成的作用机制-文献详情-维普官网

文献检索

任意字段

文献信息

任意字段
主题词
篇关摘
篇名
关键词
摘要
作者
第一作者
作者单位
刊名
中图分类号
学科分类号
DOI
基金

智能检索

高级检索

检索历史

基于SSCs/OCs探讨木豆异黄酮预防骨质疏松症形成的作用机制认领

作者：

马超

学位授予单位：

广州中医药大学

摘要：

目的: 骨质疏松症是一种在临床上广泛见到的慢性骨代谢性疾病,其主要特点包括骨密度降低、骨微观结构遭受破坏以及随之而来的骨骼脆性增加和高风险的严重骨折。尽管此疾病可能影响所有年龄段的人群,但在绝经后女性和老年男性中更为普遍。尤其需要注意的是,骨质疏松症和伴发的脆性骨折是老年人致残和死亡的常见原因之一。随着我国人口老龄化问题的日趋严峻,骨质疏松症已经成为我国社会面临的一个重大公共健康挑战。虽然目前临床治疗手段已显示出一定成效,但其潜在的多重风险也不容忽视。因此,急需发掘新的、安全有效的治疗策略。天然草药及其活性成分在缓解骨质流失和预防、治疗骨质疏松症方面,已被证实具有独特的效果和高安全性,特别是某些天然黄酮类化合物,由于其良好的骨组织相容性和靶向性,已成为治疗骨相关疾病的一个重要的替代资源。本项研究聚焦于骨伤科常用中药木豆叶中的有效成分木豆异黄酮,通过体外实验及动物模型的建立,主要研究木豆异黄酮在抑制破骨细胞形成、促进骨骼干细胞成骨分化以及调节骨重塑过程中的双向作用机制。方法: 本研究分为体外和体内实验,体外实验主要利用小鼠BMMs、RAW264.7细胞系和SSCs为研究对象,利用分子生物学、病理学等手段明确木豆异黄酮阻碍破骨细胞形成和促进骨骼干细胞成骨分化的效果和分子机制,并通过构建雌激素缺乏性骨质疏松症模型小鼠验证其阻碍骨质疏松症形成的体内效果,具体研究方法主要分三个部分: 第一部分:以小鼠原代BMMs和RAW264.7细胞系为主要研究对象,分别用不同浓度的木豆异黄酮干预BMMs和RAW264.7细胞系进行细胞增殖毒性测试,在通过细胞毒性测试后,继续用不同浓度的木豆异黄酮干预RANKL诱导的破骨细胞形成过程,并筛选出具有最佳抑制效果的浓度,随后用有效浓度的木豆异黄酮干预破骨细胞分化成熟过程中的F-actin环形成,并用qPCR和免疫印记等分子生物学方法检测破骨细胞分化和成熟过程中特异性基因和蛋白的表达情况。在明确了木豆异黄酮对破骨细胞的抑制效果后,随即收集总RNA进行RNA Bulk测序,并用生物信息学、分子生物学、免疫荧光和流式细胞仪等方法和设备分析、检测破骨细胞分化和成熟过程中相关信号通路的表达情况和潜在的结合靶点,用激光共聚焦显微镜评估关键转录因子活化T细胞核因子1(NFATc1)和p65蛋白的核迁移情况,并添加了靶点特异性抑制剂验证其可靠性。第二部分:利用小鼠骨骼干细胞为主要研究对象,通过用不同浓度的木豆异黄酮干预骨骼干细胞进行细胞增殖毒性测试,通过细胞毒性测试后,用不同浓度的木豆异黄酮干预骨骼干细胞的成骨分化过程,从中筛选出效果最佳的促成骨浓度,随后用qPCR检测经该有效浓度干预后的成骨分化标志物表达情况。第三部分:通过构建去卵巢雌激素缺乏性骨质疏松症疾病小鼠模型,在小鼠适应了饲养环境后,随机地,将全部小鼠分为3组,分别为模型组、假手术组和药物组,在造模手术恢复后,分别用木豆异黄酮或生理盐水进行治疗,整个干预过程持续6周,每周记录一次体重,干预结束后,分别收集下肢股骨样本,随后行Micro-CT扫描和重建分析,将经过扫描的股骨样本继续浸泡在EDTA溶液中进行脱钙处理,然后进行脱水、切片等处理,最后根据实验实验要求,分别行苏木素伊红染色、酒石酸抗性酸性磷酸酶染色、Masson染色、碱性磷酸酶染色和PTGS1免疫荧光染色以评估木豆异黄酮预防骨质疏松症形成的效果和调节骨重塑的分子机制。结果: 实验结果表明:木豆异黄酮可有效阻碍破骨细胞形成并促进骨骼干细胞成骨分化,同时能预防雌激素缺乏引起的骨量丢失。具体研究结果分为三部分: 第一部分:0-50μM浓度的木豆异黄酮对小鼠原代BMMs和RAW264.7细胞系无明显细胞毒性效果,且随着木豆异黄酮浓度的升高,对RANKL诱导的破骨细胞形成抑制效果越明显,其中,40μM浓度的木豆异黄酮可显著抑制RANKL诱导骨髓巨噬细胞形成破骨细胞,同时,40μM浓度的木豆异黄酮可显著抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞形成破骨细胞和F-actin环形成。通过qPCR检测发现,20μM和40μM木豆异黄酮能显著抑制破骨细胞骨形成相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)和骨吸收功能相关基因ATP酶H+转运溶酶体辅助蛋白(Atp6v0d2)、组织蛋白酶K(Ctsk)、基质金属酶9(Mmp9)的表达。同时,免疫印记结果显示:RANKL会导致破骨细胞分化和骨吸收相关蛋白CTSK、MMP9和c-Fos的表达逐渐升高,其中CTSK、MMP9在RANKL诱导后的第5天表达最高。木豆异黄酮能在干预第3天后抑制MMP9、cFos蛋白的表达,并在第5天能逆转CTSK和MMP9的表达。RNA转录组学结果显示:在木豆异黄酮干预下,上调的基因数目达336个,下调的基因数达882个,差异不明显的基因达11497个,木豆异黄酮的干预下调了Atp6v0d2、Acp5、Ctsk、Mmp9、NFATc1等破骨细胞分化和吸收相关基因的水平,通过对差异基因行KEGG通路富集分析发现,木豆异黄酮的干预效果主要与MAPK和NF-κB信号通路有关。从短时间免疫印记结果发现,40μM木豆异黄酮在RANKL干预的早期(10min至20min)的时候显著抑制ERK和JNK蛋白的磷酸化水平,在第10min的时候抑制了p38蛋白的磷酸化表达。同时,40μM木豆异黄酮在早期(10-20min)对IκBα蛋白的降解无明显逆转作用,而在30min至60min显著降低了IκBα蛋白的降解。同时,p65蛋白的免疫荧光染色显示:40μM木豆异黄酮阻碍了p65蛋白的核内转移。随后,流式细胞仪检测结果显示:40μM木豆异黄酮还通过抑制钙离子震荡水平来阻碍NFATc1,但对活性氧没有明显的抑制作用,对抗氧化基因的表达也无明显促进作用。此外,从RNA转录组学数据中发现,Ptgs1基因在木豆异黄酮的干预后显著上调,而在RANKL干预后显著降低,结合分子对接结果发现Ptgs1可能为木豆异黄酮的效用作用靶点,通过添加TFAP(Ptgs1特异性抑制剂)后发现其能逆转木豆异黄酮的抗破骨细胞形成的趋势。第二部分:不同浓度的木豆异黄酮对骨骼干细胞无明显毒性作用,与对照组相比,0.25μM和0.5μM浓度均能促进骨骼干细胞成骨分化,且随着木豆异黄酮浓度的升高,对骨骼干细胞的成骨分化促进效果越明显。qPCR实验结果显示:与对照组相比,0.25μM和0.5μM浓度的木豆异黄酮被证实可以有效地促进成骨相关基因(包括RUNT相关转录因子2(RUNX2)、碱性磷酸酶(ALP)和成骨细胞特异基因(OSX))的表达。第三部分:在整个动物造模和干预的过程中,所有小鼠均未出现死亡或报告任何显著的不良事件,动物的存活率达100%,且药物的干预未对小鼠的体重产生明显的负面影响。从Micro-CT结果显示:模型组成功构建了骨质疏松症疾病模型小鼠,与模型组对比,木豆异黄酮能有效减轻雌激素缺乏引起的骨量丢失,这体现在木豆异黄酮干预后能逆转骨微结构参数,包括骨小梁的体积分数(BV/TV)、骨小梁的表面积(B.S)、骨小梁的数目(Tb.N)和骨密度(BMD)。此外,HE染色结果显示:与模型组相比,药物组样本骨小梁间隔更小,数目更多且骨小梁的连续性更好。TRAcP染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮能有效降低骨小梁表面破骨细胞的数量和活性区域。PTGS1免疫荧光染色结果显示:木豆异黄酮能提高骨组织内PTGS1的表达量。ALP染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮干预组的小鼠股骨表现出更强的ALP染色强度,表明有更多的新骨形成。Masson染色显示:与模型组对比,木豆异黄酮干预组有更多的成熟骨组织,而模型组的非成熟骨组织更多。结论: 本研究以骨伤科常用药木豆叶的有效成分木豆异黄酮为干预条件,以骨形成和骨吸收相关的骨骼干细胞和破骨细胞为研究对象,并构建雌激素缺乏性骨质疏松症疾病模型小鼠,从体内和体外验证了木豆异黄酮抑制破骨细胞形成和促进骨骼干细胞成骨分化的效果,并可预防雌激素缺乏引起的骨量丢失。木豆异黄酮对小鼠BMMs和RAW264.7细胞系增殖无显著毒性作用,木豆异黄酮对RANKL诱导的破骨形成具有显著的抑制作用,并且这种抑制效果与其浓度呈正相关,呈现出剂量依赖性。同时,木豆异黄酮能有效抑制F-actin环形成和破骨细胞成熟和功能相关的基因和蛋白的表达,从RNA转录组学、免疫印记和激光共聚焦结果分析,在RANKL刺激下,木豆异黄酮主要通过抑制p38/ERK/JNK/MAPK和NF-κB信号通路来降低破骨细胞形成,进而抑制关键因子NFATc1的向细胞核内转移趋势,抑制下游的破骨细胞特异性基因的扩增和蛋白的翻译。同时,木豆异黄酮还能通过抑制钙离子震荡水平来阻碍NFATc1的入核,但对活性氧无明显抑制效果。此外,Ptgs1为木豆异黄酮发挥效应的具体作用靶点,抑制Ptgs1能逆转木豆异黄酮的抗破骨细胞形成效应。木豆异黄酮对骨骼干细胞无明显毒性作用,木豆异黄酮能促进骨骼干细胞成骨分化过程,且与浓度呈正相关,木豆异黄酮还能促进成骨标志物基因的表达,提升RUNX2、ALP、OSX的表达水平。通过去卵巢的方式成功构建了雌激素缺乏性骨质疏松症疾病模型小鼠,4mg/kg浓度的木豆异黄酮对小鼠无明显毒性作用。体内实验结果表明,木豆异黄酮能减轻雌激素缺乏引起的骨量丢失,逆转骨微结构参数和维持骨小梁的完整性和连续性,提高PTGS1的表达水平,并能抑制破骨细胞的数目,且能促进新骨生成和维持成熟骨的含量,可作为新的骨质疏松症的替代治疗方案。

摘要译文

关键词：

木豆异黄酮; 破骨细胞; Ptgs1; 骨骼干细胞; 雌激素缺乏性骨质疏松症

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

中医骨伤科学

导师：

牛维

中图分类号：

R259[现代医学内科疾病+⑨]

学科分类号：

100507[中医内科学]

D O I：

10.27044/d.cnki.ggzzu.2024.000071