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生酮饮食对氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠的神经保护作用及其机制研究认领

作者：

乔琦

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

癫痫是一种由脑神经元异常同步化放电所致的慢性脑部疾病,以慢性反复自发性发作为特征,是最常见的神经系统疾病之一,全球发病率约为6.38‰-7.60‰,其中约30%的患者尽管应用了合理的药物治疗,其发作仍得不到有效缓解,被称为难治性癫痫。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是最常见的难治性癫痫类型,以反复性自发性癫痫发作(spontaneous recurrent seizures,SRSs)为特征,并多伴有学习记忆能力下降、注意力缺陷、多动、焦虑、执行障碍等认知、精神共患病,严重影响患者的生活质量。因此深入研究癫痫的病理机制,探索既能抑制癫痫发作同时又能改善癫痫相关的认知障碍的新型治疗策略具有重要的临床意义。TLE合并认知障碍的机制尚不明确,但海马神经元丢失与突触可塑性受损是两个已经证实的因素。TLE一方面通过损伤突触可塑性,影响海马神经环路中突触间的传递效率而损害认知功能;另一方面通过海马神经元丢失、苔藓纤维出芽等病理损害引发突触重组,导致异常的海马神经环路形成,进而影响认知功能。此外,海马神经元丢失还可提高神经网络的兴奋性,促进癫痫发生。细胞凋亡是生物体内最常见的一种程序性细胞死亡方式,也是癫痫导致神经元死亡的重要机制,可分别通过线粒体通路、内质网通路以及死亡受体通路被激活,其中线粒体通路与内质网通路均属于内源性凋亡途径,两者存在明显的交联关系,共同参与TLE的癫痫发生及神经元凋亡。因此,改善海马突触可塑性,抑制线粒体及内质网通路介导的海马神经元凋亡对于癫痫及其认知共患病的治疗具有十分重要的意义。生酮饮食(ketogenic diet,KD)是一种高脂肪、低碳水化合物、适量蛋白质的特殊饮食,常被用于难治性癫痫的治疗中。研究显示KD可有效控制癫痫发作次数,降低癫痫的致死率;此外,还具有一定的改善认知与情绪的作用。目前已知KD的作用机制可能涉及调节神经递质、抑制氧化应激、调节炎症介质、维持能量代谢等,但KD对突触可塑性及细胞凋亡的影响尚不明确。氯化锂-匹罗卡品诱导的大鼠癫痫模型具备人类TLE的癫痫发生及海马损伤等主要特点,是目前公认的研究TLE的动物模型。本实验在该模型上评价了KD对癫痫发生及癫痫相关认知损害的治疗作用,并对其可能的作用机制进行深入的探讨,以期寻找到TLE及其认知共患病的新的治疗靶点。第一部分氯化锂-匹罗卡品颞叶癫痫大鼠模型的建立及生酮饮食对癫痫发生的影响目的:建立氯化锂-匹罗卡品(pilocarpine,Pilo)诱导的TLE大鼠模型,通过观察行为学及脑电监测分析KD对SRSs及发作间期癫痫样放电(interictal epileptiform discharges,IEDs)的影响,以明确KD对癫痫发生的作用。方法:将40只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成4组:正常对照组(Control组,n=8),匹罗卡品组(Pilo组,n=12),匹罗卡品+生酮饮食组(Pilo+KD组,n=12),生酮饮食组(KD组,n=8)。对Pilo组及Pilo+KD组大鼠先后腹腔注射氯化锂及匹罗卡品,以诱导癫痫持续状态(status epilepticus,SE),Control组及KD组腹腔注射生理盐水。SE后3天,给予Pilo+KD组及KD组大鼠KD治疗,给予Control组及Pilo组大鼠正常饮食。各组大鼠连续喂养28天后均恢复正常饮食。使用血酮仪分别在饮食干预前及干预后第7天、14天、21天、28天检测尾静脉血中的β-羟丁酸的浓度,以观察生酮饮食是否生效。在SE后第8天,使用高清摄像头连续监测大鼠行为学改变,并记录各组大鼠SRSs发生率、潜伏期、发作频率。在SE后第38天,监测各组大鼠皮层及海马脑电图的变化,并统计各组大鼠每次SRSs持续的时间及棘波放电的频率。结果:1.Pilo组1只大鼠未达到SE标准,11只大鼠成功诱发SE,但其中有3只大鼠在SE后死亡;Pilo+KD组全部成功诱发SE,4只大鼠在SE后死亡,模型成功率为67%。Control组及KD组大鼠均无抽搐发作,最终每组有8只大鼠可纳入实验。在进行饮食干预后,正常饮食组大鼠(Control组及Pilo组)的血β-羟丁酸浓度保持在较低的水平;而接受生酮饮食的大鼠(Pilo+KD组及KD组)在饮食干预后的前2周血β-羟丁酸浓度迅速升高,并稳定在一个较高的水平,证明生酮有效。2.视频系统监测大鼠行为学改变:Pilo组及Pilo+KD组中每只大鼠都出现了SRSs发作,发生率均达100%;Control组及KD组均无SRSs发作。Pilo+KD组SRSs潜伏期明显长于Pilo组(20.63±2.18天vs14.38±1.10天,P<0.05)。此外,Pilo+KD组大鼠SRSs的发作频率也显著低于Pilo组(1.13±0.21次/天vs1.91±0.28次/天,P<0.05)。3.脑电图观察IEDs:Control组及KD组大鼠脑电图基本正常,以α或β节律为主,频率为6-18Hz,波幅在10～60u V,节律规则,未出现慢波、尖波、棘波、棘慢波等异常波。而Pilo组及Pilo+KD组大鼠则可监测到分散的尖波、棘波、棘慢波等癫痫波,并且Pilo+KD组大鼠皮层及海马棘波放电的频率明显低于Pilo组。4.脑电图观察SRSs:Pilo+KD组SRSs癫痫波的频率及波幅均明显低于Pilo组,发作后抑制期也短于Pilo组。然而,Pilo+KD组SRSs的平均持续时间虽也短于Pilo组(41.54±1.32s vs 46.38±1.65s),但差异并不明显(P>0.05)。结论:KD并不能抑制癫痫大鼠SRSs的出现,但可明显延长SRSs的潜伏期,降低SRSs的发作频率,并通过降低癫痫波的波幅及频率减弱SRSs发作时的电活动强度,而对SRSs放电持续时间的影响并不明显。此外,KD干预还可明显降低癫痫大鼠发作间期皮层及海马IEDs的频率。由此说明,KD可在一定程度上抑制TLE大鼠的癫痫发生。第二部分生酮饮食对颞叶癫痫大鼠认知功能的保护作用目的:观察KD对TLE大鼠认知功能及突触可塑性的影响。方法:在成功建立SE模型后,癫痫组(Pilo组)及癫痫+生酮饮食组(Pilo+KD组)每组有13只大鼠可纳入实验中,另设有正常对照组(Control组,n=14)及生酮饮食组(KD组,n=14),总共4组。饮食干预方法同第一部分。在SE后第52天,每组随机选取8只大鼠进行水迷宫测试。完成行为学实验后通过在体长时程增强(long-term protentiation,LTP)记录海马场兴奋性突触后电位(field excitatory postsynaptic potential,f EPSP),以评价突触的功能可塑性。其后将大鼠处死,通过透射电镜观察海马CA1区突触超微结构;高尔基染色分析海马树突棘的密度,以评价突触的结构可塑性。最后通过Western blot检测海马突触相关蛋白的表达。结果:1.水迷宫检测:在定位航行实验的第2-5天,Pilo组大鼠的逃避潜伏均明显长于Control组;在第4-5天,Pilo+KD组的逃避潜伏期较Pilo组明显缩短;Control组与KD组的逃避潜伏期始终没有明显差异。在空间探索实验中,与Control组相比,Pilo组大鼠在目标象限的停留时间明显缩短,穿越平台的次数也显著减少。而与Pilo组相比,Pilo+KD组大鼠在目标象限的停留时间明显延长,穿越平台的次数也显著增加。Control组与KD组,在目标象限停留的时间及穿越平台的次数上均无明显差异。在可视平台实验中,各组大鼠的逃避潜伏期及平均游泳速度无明显差异。2.LTP结果:四组基础波幅无明显差异,在给予高频刺激后的1min、30min和60min,Pilo组在各时间点的f EPSP幅度均显著低于Control组;而Pilo+KD组在各时间点的f EPSP幅度均显著高于Pilo组;KD组与Control组间f EPSP的幅度在各时间点均无明显差异。3.海马CA1区突触超微结构:Pilo组大鼠突触PSD厚度显著低于Control组,而Pilo+KD组PSD厚度较Pilo组则明显增加。此外,与Control组相比,Pilo组突触间隙宽度显著增加,而Pilo+KD组突触间隙宽度较Pilo组则明显变窄;KD组与Control组突触间隙宽度及PSD厚度均无明显差异。4.树突棘密度:与Control组相比,Pilo组海马CA1及CA3区树突棘密度均显著降低;而与Pilo组相比,Pilo+KD组CA1区树突棘的密度明显增加,但CA3区树突棘密度增加并不明显;KD组与Control组CA1及CA3区树突棘密度均无显著差异。5.突触相关蛋白表达:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中Syp、Syt 1、SNAP-25及PSD-95的表达均显著降低;而Pilo+KD组上述突触相关蛋白的表达量则明显高于Pilo组;KD组与Control组间,突触相关蛋白的表达量无明显差异。结论:TLE大鼠出现了明显的空间学习、记忆能力的损害及突触可塑性的改变。而KD上调了突触相关蛋白的表达,改善了突触的结构及功能可塑性,包括:改善海马CA1区突触的超微结构、提高树突棘的密度、增强LTP效应等,这可能是KD改善癫痫相关认知功能损害的原因之一。第三部分生酮饮食可能通过抑制ASIC1a及线粒体凋亡通路发挥神经保护作用目的:研究KD对TLE大鼠海马神经元的保护作用,并进一步探索KD对ASIC1a及线粒体凋亡途径的影响,以期发现KD在TLE中发挥神经保护作用的潜在机制。方法:成功建立SE模型后,癫痫组(Pilo组)及癫痫+生酮饮食组(Pilo+KD组)每组有18只大鼠可纳入实验中,另设有正常对照组(Control组)及生酮饮食组(KD组),各18只,总共4组。饮食干预方法同第一部分。在SE后第9周将大鼠处死,通过Nissl染色观察各组大鼠海马CA1及CA3区海马神经元形态及丢失情况;通过流式细胞术检测海马神经细胞内钙离子浓度(intracellular Ca2+concentration,[Ca2+]i)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)以及细胞凋亡情况;通过透射电镜观察海马CA1区线粒体的超微结构;通过Western blot检测大鼠海马组织总蛋白中酸敏感离子通道(acid-sensing ion channel 1a,ASIC1a)、Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3的表达,以及线粒体及胞浆蛋白中的细胞色素c(cytochrome c,Cyt c)的表达。结果:1.Nissl染色结果:Control组及KD组大鼠海马CA1及CA3区锥体神经元密集且排列整齐,结构完整,尼氏小体丰富,核仁清晰;Pilo组锥体神经元排列稀疏、杂乱,结构不完整,尼氏小体减少,细胞核固缩;而Pilo+KD组锥体神经元排列及结构相对正常。此外,Pilo组海马CA1及CA3区锥体神经元的数量均明显少于Control组;而Pilo+KD组CA1及CA3区神经元的数量较Pilo组则显著增加;KD组海马神经元的数量较Control组无明显差异。2.ASIC1a的表达:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中ASIC1a蛋白的表达在癫痫慢性期显著上调;而Pilo+KD组ASIC1a的表达则明显低于Pilo组,但仍高于Control组;KD组与Control组ASIC1a的表达无明显差异。3.流式细胞术结果:与Control组相比,Pilo组大鼠海马组织中[Ca2+]i升高,MMP下降,ROS产生增多,细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义;而与Pilo组相比,而Pilo+KD组大鼠海马组织中[Ca2+]i明显降低,MMP显著升高,ROS产生明显减少,细胞凋亡率也显著降低。Control组与KD组间上述各项指标无明显差异。4.线粒体超微结构:Control组及KD组线粒体结构正常、无肿胀、基质密度高,

摘要译文

关键词：

颞叶癫痫; 生酮饮食; 认知功能; 线粒体凋亡; 内质网应激

学位年度：

2022

学位类型：

博士

学科专业：

神经病学（专业学位）

导师：

王维平

中图分类号：

R742.1[癫痫⑨]

学科分类号：

100210[神经病学]

D O I：

10.27111/d.cnki.ghyku.2022.001179