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手性无机纳米材料在阿尔茨海默病调控及相关药物筛选中的应用研究认领

作者：

胡姝洋

学位授予单位：

河北医科大学

摘要：

阿尔茨海默病（AD）发病机制复杂,且各病理因素相互作用形成恶性循环。因此,开发基于多靶点协同机制的药物是治疗AD的有效策略。纳米材料因其独特的结构优势、良好的稳定性、较大的比表面积以及血脑屏障（BBB）穿透性等优良特性,作为AD治疗药物或者诊疗试剂引起了广泛的关注,具有广阔的应用前景。由于体内复杂的手性微环境,手性相互作用参与了体内众多关键的生物反应,纳米材料的手性会直接影响其进入细胞的途径、在生物体内的行为及最终治疗效果。手性是药物设计、药理学、毒理学、药代动力学需考虑的重要因素。同时,在一对对映体药物中,有时只有一种对映体显示出理想的药物活性,而另一种没有药物活性,甚至可能引起不必要的副作用。基于此,本论文将手性这一自然界普遍存在的内在特征引入到纳米药物的设计中,构建一系列手性纳米平台,用于立体选择性调控阿尔茨海默病及相关手性药物的筛选。为AD早期治疗提供新的思路和研究方向,推动新型抗AD手性药物的开发。第一部分手性多金属氧酸盐立体选择性调控β-淀粉样蛋白沉积用于治疗阿尔茨海默病目的:基于手性识别对抑制β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集的关键影响,开发纳米尺度的手性抑制剂,用于立体选择性识别及抑制Aβ聚集,以实现AD的治疗。方法:通过引入ZrⅣ离子,将非手性多金属氧酸盐（POM）与手性酒石酸（L/D-TA）相连接,制备一对具有内在手性的多金属氧酸盐（L/D-POM）纳米团簇。采用紫外-可见光谱（UV-Vis）、红外光谱（FT-IR）和圆二色谱法（CD）对合成的手性L/D-POM进行表征。利用硫黄素T（ThT）荧光法考察L/D-POM对Aβ40纤维化聚集动力学的影响,原子力显微镜（AFM）、透射电子显微镜（TEM）表征Aβ聚集体的形貌,CD和全反射红外（ATR-FTIR）表征Aβ聚集体的二级结构。通过核磁共振波谱法（NMR）、bis-ANS荧光等实验手段及分子动力学（MD）模拟得到L/D-POM与Aβ的作用位点及结合模型。使用氮蓝四唑（NBT）等检测体系研究手性POM的抗氧化能力。以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）为细胞模型,通过四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法等考察L/D-POM对Aβ介导的细胞毒性的抑制作用。采用溶血实验、苏木精&伊红（H&E）染色等方法分析L/D-POM在体内外的生物安全性。以健康C57BL/6J小鼠为正常动物模型,监测L/D-POM在体内跨BBB效率。以APP/PS1双转基因小鼠为AD动物模型,利用Morris水迷宫（MWM）及免疫组织化学（IHC）等实验综合评估手性POM的体内治疗效果及手性差异。结果:UV-Vis、FT-IR、CD等一系列表征方法证明了L-POM及D-POM纳米团簇的成功制备。ThT荧光法及AFM、TEM图像表明L/D-POM能够抑制Aβ聚集体的形成。L-POM和D-POM抑制Aβ聚集的IC50值分别为17.38μM和2.63μM,进一步证明D-POM的抑制能力优于L-POM。荧光滴定实验计算出D-POM以及L-POM的结合常数分别为1.07×10～6 M-1和5.40×10～5 M-1,经MD模拟计算得到L-POM及D-POM与Aβ间的结合能分别为-476.00 kcal mol-1和-556.98kcal mol-1,以上结果说明了D-POM对Aβ表现出更强的亲和力。此外,手性POM显示出了超氧化物歧化酶（SOD）类酶活性,还能够清除羟基自由基（·OH）。体外细胞实验表明,L/D-POM能够缓解Aβ介导的细胞毒性,并显示出手性选择性作用。体内研究证明了L/D-POM可以穿透BBB,结合其自身的ROS清除活性,L/D-POM表现出改善AD模型小鼠认知缺陷的能力,能明显抑制APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积、缓解神经炎症以及减轻神经元损伤。其中,D-POM具有更佳的疗效。结论:本研究所合成的具有固有手性的L/D-POM可以手性识别并选择性地抑制Aβ40聚集。动物实验结果显示,L/D-POM能够穿透BBB,可明显提高AD模型小鼠的认知能力,且D-POM的治疗效果明显优于L-POM。我们的工作将为AD手性药物的开发提供理论依据和实验支持。第二部分手性硒掺杂碳点调控β-淀粉样蛋白和神经元铁死亡多靶点协同治疗阿尔茨海默病的研究目的:考虑到AD复杂的发病机制和各种病理因素的相互作用,针对AD早期致病因子Aβ与神经元铁死亡设计手性纳米药物,在抑制Aβ聚集和神经元铁死亡的同时,调节脑铁代谢并减少炎症反应,以实现多靶点协同治疗AD。方法:以精氨酸为前驱体、手性环己二胺为手性基团、硒氰酸钾为硒掺杂剂,通过微波辅助水热法合成具有高手性稳定性的超小尺寸手性硒掺杂碳点（S/R-Se CDs）。随后,利用TEM、UV-Vis、CD、拉曼光谱及X射线光电子能谱（XPS）等多种手段对合成的S/R-Se CDs进行表征。使用NBT光还原法、自由基比色法等手段考察S/R-Se CDs的抗氧化能力。采用ThT荧光法、TEM以及NMR、bis-ANS荧光法等分别研究S/R-Se CDs对Aβ聚集的抑制作用以及手性选择性结合的作用机制。选择PC12细胞用于考察S/R-Se CDs能否缓解Aβ介导的神经毒性。Aβ聚集体的细胞毒性利用MTT法、游离钙离子浓度、线粒体膜电位等手段表征。同时,以铁死亡激活剂Erastin诱导的PC12细胞为神经元铁死亡细胞模型,使用荧光成像、Western Blot等方法研究S/R-Se CDs抑制神经元铁死亡的作用及作用机制。以APP/PS1小鼠为动物模型,评估S/R-Se CDs的体内抗AD作用,并通过Western Blot方法测定铁死亡相关指标在AD小鼠脑中的表达。结果:TEM、XPS、CD等方法证明了手性S/R-Se CDs的成功合成。同时,S/R-Se CDs具有优异的抗氧化性能。在一系列体外实验中,S/R-Se CDs对Aβ聚集有明显的手性抑制作用,并且能降低Aβ聚集体诱导的细胞毒性,高浓度的R-Se CDs可以将PC12细胞活性从54.98%提高至90%。此外,S/R-Se CDs可以抑制神经元铁死亡,其中R-Se CDs对铁死亡的抑制能力优于S-Se CDs。体内实验表明,S/R-Se CDs能够穿透BBB到达小鼠脑部及海马体中,并且S-Se CDs组小鼠脑内及海马体的Se含量低于R-Se CDs组。动物水平的MWM测试、IHC以及Western Blot等实验结果显示手性S/R-Se CDs能够降低APP/PS1小鼠脑内Aβ沉积,减轻炎症反应,保护神经元免受损伤,同时还影响铁死亡相关蛋白的表达水平,从而提高了APP/PS1小鼠的认知功能,与S-Se CDs相比,R-Se CDs取得了更佳的体内治疗效果。结论:本研究针对AD早期致病因子,基于Se优异的特性合成了手性S/R-Se CDs。手性S/R-Se CDs能够手性选择性抑制Aβ聚集,并且具备抗氧化活性以及对神经元铁死亡的抑制能力,从而提高了APP/PS1小鼠的认知功能。此项工作对于抗AD手性药物的发展具有重要的研究意义和潜在的临床应用价值。第三部分手性FexCuySe NPs作为过氧化物酶模拟物通过比色法检测多巴对映体目的:手性药物在神经退行性疾病的临床药物中占比超过50%。手性药物的对映体在生化活性、效价、毒性、转运机制和代谢途径等方面存在显著差异。发展区分手性药物对映体的方法在药物科学中具有重要意义。因此,本部分研究以区分L-3,4-二羟基苯丙氨酸（左旋多巴,L-dopa）和D-3,4-二羟基苯丙氨酸（D-dopa）为例,构建一种简便的高通量传感平台,用于筛选神经退行性疾病的手性药物。方法:以L-组氨酸（L-His）或D-组氨酸（D-His）为手性配体,通过配位作用偶联到FexCuySe NPs表面,制备L/D-FexCuySe NPs。使用UV-Vis、TEM、FT-IR及CD等手段对制备的纳米粒子进行表征。通过催化H2O2氧化TMB的反应评价FexCuySe NPs的类过氧化物酶（POD）活性。随后,以L/D-dopa为底物探讨了L/D-FexCuySe NPs检测L/D-dopa对映异构体的可行性。使用MD模拟计算L/D-His和L/D-dopa之间的相互作用,进一步说明传感器的工作原理。最后采用该比色传感器测定市售片剂药物中左旋多巴的浓度,以评估其在实际药品质量监控应用中的可行性。结果:UV-Vis、TEM、FT-IR及CD等表征手段证明了非手性FexCuySe NPs及手性L/D-FexCuySe NPs的成功合成,这些纳米材料具有POD类酶活性。手性FexCuySe NPs表面的手性配体L/D-His赋予其催化多巴对映体氧化的手性选择性。根据酶反应动力学参数kcat/Km值可知,L-FexCuySe NPs对L-dopa的催化效率是D-dopa的1.56倍。与之相反的是,D-FexCuySe NPs对D-dopa具有更高的亲和性。由于L-FexCuySe NPs在L-dopa氧化过程中具有高催化活性和手性选择性,基于L-FexCuySe NPs的体系可用于检测L-dopa。L-dopa测定的线性范围分别为5μM-0.125 mM和0.125 mM-1 mM,检测限为1.02μM。此外,该比色传感器成功应用于市售左旋多巴片的质量控制。结论:基于手性FexCuySe NPs在多巴对映体氧化过程中的高催化活性和立体选择性,我们构建的新型比色传感器可以应用于临床使用的实际药品左旋多巴片剂的质量控制。我们的研究为开发简单和灵敏的手性纳米材料传感器用于手性药物筛选提供了启发。

摘要译文

关键词：

阿尔茨海默病; β-淀粉样蛋白; 铁死亡; 手性; 药物筛选

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

药剂学

导师：

李蒙

中图分类号：

TB383.1;R749.16;R943[制剂学]

学科分类号：

083611[医药生物工程];100603[中西医结合药学];100702[药剂学]

D O I：

10.27111/d.cnki.ghyku.2024.000249