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龟鹿二仙胶调控p62自噬介导Keap1/Nrf2通路活化治疗少弱精子症的研究认领

作者：

丁劲

学位授予单位：

湖南中医药大学

摘要：

目的:探讨龟鹿二仙胶改善雷公藤多苷诱导少弱精子症(OAS)大鼠生殖损伤、减轻氧化损伤小鼠精原细胞氧化应激和自噬水平,以及潜在作用机制。方法: 1.应用雷公藤多苷混悬液连续灌胃4周造模OAS模型大鼠。将OAS大鼠随机分成模型组,龟鹿二仙胶低、中、高剂量组,维生素E组,给予相应药物和剂量灌胃,正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃,连续4周。H&E染色观察睾丸和附睾组织形态学变化;CASA检测精子浓度和活力;TEM观察精子线粒体结构变化;流式细胞术检测睾丸组织ROS、精子线粒体膜电位(MMP)水平;ELISA检测睾丸组织GSH、GPX4、MDA水平;IF检测睾丸组织p62、GPX4免疫荧光强化;IHC检测睾丸组织Nrf2表达;WB检测睾丸组织p62、LC3B、Keap1、核内 Nrf2、HO1、GPX4 相对蛋白表达;RT-qPCR测定 Keap1、Nrf2、HO1 相对 mRNA 表达。 2.H2O2处理小鼠精原细胞24 h,随后不同浓度龟鹿二仙胶含药血清干预24 h,观察细胞活力、ROS以及MDA水平以筛选最佳含药血清浓度;RT-qPCR验证不同敲低位点Keap 1的敲低效率;后续实验选用 RAPA 处理小鼠精原细胞 72 h 或转染经过筛选验证的Keap1-siRNA 24 h,随后给予已筛选的浓度含药血清干预24 h。CCK-8检测细胞活力;TEM观察自噬相关囊泡的结构变化;流式细胞术检测细胞ROS水平;ELISA检测细胞MDA水平;WB检测细胞mTOR、p-mTOR、p62、Keap 1、Nrf2、LC3B 表达;IF检测细胞 p62、Nrf2 免疫荧光强度。结果: 1.与正常组相比,模型组大鼠睾丸组织曲细精管萎缩、排列不规则、管腔间隙增大,其内生精细胞数量明显减少,并且细胞排列疏松、紊乱;附睾组织管腔间隙增加、间质组织减少、腔内上皮细胞排列紊乱或缺失,呈矮柱状,未见或少见精子;附睾精子浓度和活力显著下降(P<0.0001);睾丸组织MDA和ROS水平显著增加(P<0.001),GSH和 GPX4 水平显著下降(P<0.01);精子 MMP 水平显著下降(P<0.01);精子线粒体肿胀、纤维疏松、轴丝断裂,9+9+2结构破坏显著;IF 测定的睾丸组织 p62、GPX4 免疫荧光强度显著下降(P<0.01);IHC测定的睾丸组织Nrf2表达显著下降(P<0.01);WB测定的 p62、核内 Nrf2、HO1、GPX4 表达显著下降(P<0.05),LC3B-II/LC3B-I 比值及 Keap1 表达显著增加(P<0.01)。RT-qPCR 测定的 Keap1 表达显著增加(P<0.001),Nrf2、HO1表达显著下降(P<0.0001)。与模型组比较,龟鹿二仙胶各组及维生素E组大鼠睾丸组织病变程度及范围显著减轻,曲细精管尚为完整,管缘内各级生精细胞排列稍紊乱,管内可见较多生精细胞;附睾组织腔外组织充实有序,腔内上皮细胞数量增加、排列尚整齐、结构尚完整,可见较多精子;龟鹿二仙胶高剂量组精子浓度和活力显著增加(P<0.05);龟鹿二仙胶高剂量组对精子活力改善作用优于低、中剂量组(P<0.05),与维生素E组相比无显著差异(P>0.05);龟鹿二仙胶高剂量组对精子浓度改善作用优于低剂量组(P<0.05),与中剂量组、维生素E组相比均无显著差异(P>0.05);龟鹿二仙胶各组及维生素E组睾丸组织中MDA和ROS显著下降(P<0.01),GSH和GPX4水平显著增加(P<0.05);龟鹿二仙胶各组及维生素 E 组精子 MMP 显著增加(P<0.05);线粒体鞘结构尚完整,肿胀较模型组显著减轻,纤维、轴丝及微管结构较整齐、清晰和完整。IF测定的龟鹿二仙胶高剂量组睾丸组织p62、GPX4免疫荧光强度显著增加(P<0.05);IHC测定的龟鹿二仙胶高剂量组睾丸组织Nrf2表达显著增加(P<0.01);WB测定的龟鹿二仙胶高剂量组睾丸组织p62、核内 Nrf2、HO1、GPX4表达显著增加(P<0.05),LC3B-II/LC3B-I 比值、Keap1 表达显著下降(P<0.01)。RT-qPCR测定的龟鹿二仙胶高剂量组睾丸组织Nrf2、HO1表达显著增加(P<0.0001),Keap1表达显著下降(P<0.0001)。 2.H202处理小鼠精原细胞 24 h,结果显示细胞活力显著下降(P<0.0001),ROS和MDA水平显著上升(P<0.05);10%浓度龟鹿二仙胶含药血清干预可显著提高氧化损伤小鼠精原细胞活力(P<0.0001),并显著降低ROS和MDA水平(P<0.05)。RAPA处理细胞72 h,相比较空白血清,WB测定显示龟鹿二仙胶含药血清干预24h 可显著增加p-mTOR、p62、Nrf2 表达(P<0.01),降低LC3B-II/LC3B-I 比值和Keap1表达(P<0.01),IF测定显示龟鹿二仙胶含药血清可显著增加p62免疫荧光强度(P<0.05),并显著降低ROS和MDA的水平(P<0.05);TEM分析表明,龟鹿二仙胶含药血清处理可显著减少细胞中异常增大的自噬溶酶体;Keap1 敲低位点siRNA-Keap1-23 11 表现出更高的敲低效率(P<0.001);siRNA-Keap 1-23 11转染的小鼠精原细胞24 h,相比较空白血清,WB测定显示龟鹿二仙胶含药血清可显著增加 p62、Nrf2 的蛋白表达(P<0.05),降低 LC3B-II/LC3B-I 比值、Keap 1 蛋白表达(P<0.05),IF测定显示龟鹿二仙胶含药血清可显著增加 Nrf2 免疫荧光强度(P<0.05),并显著降低ROS和MDA的水平(P<0.05)。结论: 1.龟鹿二仙胶治疗能够减轻雷公藤多苷诱导OAS大鼠睾丸和附睾组织病理病变,增加OAS大鼠精子浓度及活力;可能通过上调p62表达、下调LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ 比值,抑制OAS大鼠生殖细胞过度自噬;通过上调 Nrf2、HO1、GPX4 表达,下调 Keap1 表达,从而活化Keap1/Nrf2通路,使GSH和GPX4含量增加,ROS和MDA水平降低,发挥抗氧化损伤作用,改善雷公藤诱导OAS大鼠生殖损伤。 2.龟鹿二仙胶含药血清干预显著增加H2O2诱导的氧化损伤小鼠精原细胞的活力,显著降低细胞内ROS和MDA水平;龟鹿二仙胶含药血清干预显著增加RAPA处理或Keap 1-siRNA转染小鼠精原细胞的活力,可能通过上调p-mTOR、p62表达、下调LC3B-II/LC3B-I 比值及Keap 1表达、减少细胞内异常增大的自噬溶酶体,从而抑制过度自噬,并可活化 Keap1/Nrf2通路发挥抗氧化损伤作用,显著降低细胞内ROS和MDA水平。

摘要译文

关键词：

龟鹿二仙胶; 少弱精子症; 氧化应激; p62 自噬; Keap1/Nrf2 通路

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

中西医结合临床

导师：

何清湖

中图分类号：

R285.5[中药实验药理]

学科分类号：

100505[临床中药学];100805[中药分析学];100806[中药药理学];100808[临床中药学]

D O I：

10.27138/d.cnki.ghuzc.2024.000030