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光促酶催化自由基脱羧与芳香偶联反应的研究认领

作者：

郑杰

学位授予单位：

西北农林科技大学

摘要：

光催化反应作为绿色合成的新型代表,已在有机合成领域中引起了广泛关注。光催化产生的自由基物种具有多样性转化的潜力,然而其选择性控制却是合成科学面临的挑战。相比之下,酶催化由于蛋白骨架丰富的手性结构,可以实现高选择性催化转化。但是目前仅发现到三个天然光酶,这限制了酶催化在光促合成中的应用;同时酶高度进化导致的专一性使得天然酶难以对非天然底物的分子骨架进行高效催化,这进一步限制了其在功能分子合成中的应用。如何设计与改造光酶催化元件,拓展天然光酶催化的化学反应边界,是光促酶合成领域亟待解决的问题。本论文通过对天然光促脱羧酶CvFAP进行改造,拓展了其催化的底物类型;从烯还原酶催化的化学原理出发,设计了光促酶催化的自由基转化反应。本文的研究工作将化学合成与生物催化相结合,拓展了光催化反应的工具类型,丰富了生物催化的光酶元件。本文前半部分主要围绕脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）进行改造研究。脂肪酸光脱羧酶（CvFAP）是一类从小球藻（Chlorella variabilis）中发现的能够在蓝光照射下对长链脂肪酸进行脱羧变成烷烃或者烯烃类化合物的光促脱羧酶。然而天然的CvFAP仅能识别和催化链状的一级羧酸进行脱羧,对大体积的二级羧酸和三级羧酸几乎不能催化,这限制了此酶的应用,因此迫切需要对CvFAP进行定向改造使其能够对大体积的二级和三级羧酸进行脱羧。本文主要采用了聚焦理性迭代突变（FRISM）结合半理性设计的策略,对野生型的CvFAP进行改造,以具有刚性的大体积三级羧酸-金刚烷酸1a作为模板底物,经过大量筛选,发现了突变体G2（Y466F-F469V-T131V）能够对其进行高效脱羧。通过对反应条件的优化,采用10 mg/m L的冻干全细胞作为催化剂,在室温下以tris-HCl（p H 8.5）作为缓冲液进行催化脱羧。选择大体积的环己烷类、苯环类、萘环类和杂环类的二级和三级羧酸来考察该突变体的底物兼容性,结果表明,突变体G2比野生型能更好地兼容这些底物进行高效脱羧,最高收率达到96%。与此同时,将底物放大到1 mmol的规模,也能得到70%的分离收率,说明此方案具有广阔的应用前景。由于目前CvFAP只能针对α-羟基和α-氨基的链状羧酸进行动力学拆分,而不能对其它类型的羧酸进行拆分,因此有必要利用其它取代基的大体积羧酸来研究。选取野生型不能兼容的α-甲基环状二级羧酸1r为底物,采用突变体G2对其进行动力学拆分,能够达到60%的对映选择性。为了考察突变体G2比野生型更兼容的原因,本文对野生型和每一代突变体进行了动力学实验,从Km和kcat的角度来解释了每一代酶的差异性。此外也对野生型和突变体G2与底物进行了分子动力学模拟,从羧酸基团与FAD中N5之间的距离、酶与底物的结合能、反应中心的水分子数量等方面来证实了突变体比野生型更适合兼容大体积羧酸。表明本文的改造研究拓宽了FAP的底物适用范围,增加了其应用价值。由于CvFAP只能针对羧酸底物进行脱羧的去官能团化反应,如何拓展光酶的催化类型,实现光促新型化学键的构建与官能团的引入成为了我们面临的新问题。烯还原酶是一类对烯烃进行还原氢化的酶,这类酶中所包含的辅因子FMN具有光敏性,可以利用光照对此酶进行激发使其改变天然的底物类型和反应类型,达到开发新的生物催化化学反应的目的。本文的后半部分主要围绕对烯还原酶进行光赋能来开发新类型的非天然反应展开研究。采用在反应体系中不引入NADPH及其再生系统时,利用氧化状态的FMNox来启动反应,通过筛选不同的烯还原酶发现到OYE3、PQR1907、Cs ER、Nem A能够催化3-甲氧基噻吩与溴代丙二酸二乙酯进行芳香偶联反应。通过对噻吩环类、苯环类、吡咯环类、吡啶环类、呋喃环类的底物进行考察,发现此体系对噻吩环类化合物具有非常好的兼容性,最高能达到95%的催化收率。与此同时,将底物放大到1 mmol的规模,也能得到83%的分离收率,表明氧化状态的FMNox在光激发下对噻吩环类化合物进行了单电子氧化,生成的自由基阳离子对溴代丙二酸酯进行自由基取代形成新的取代产物,实现了自由基取代反应目的。本文通过将光与酶进行结合来开发光促酶的自由基反应,不仅解决了天然光酶类型有限问题,也开辟了酶催化非天然反应的新途径。作为一个新兴的交叉学科,光促酶催化的非天然反应是一个具有很大潜力的方向,将为化学与生物的深度交叉注入新的力量。

摘要译文

关键词：

光脱羧酶CvFAP; 定向进化; 二级三级羧酸脱羧; 动力学拆分; 烯还原酶; 光促酶催化; 自由基反应

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

化学生物学

导师：

高锦明周佳海古阳

中图分类号：

O621.251;O621.25[化学性质、有机化学反应]

学科分类号：

070303[有机化学];081704[应用化学]

D O I：

10.27409/d.cnki.gxbnu.2024.000193