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新型磷酸二酯酶4/5双靶点抑制剂抗神经炎症作用研究认领

作者：

赵理云

学位授予单位：

电子科技大学

摘要：

神经炎症是多种神经退行性疾病的共同病理机制,靶向神经炎症进行药物研究,可为研发神经退行性疾病药物提供候选策略。作为第二信使的环核苷酸可调节中枢神经系统(central nervous system,CNS)的各种生理过程,其中环单磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)和环单磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP)可通过参与神经炎症调控进而发挥神经保护作用。磷酸二酯酶(phosphodiesterases,PDE)是体内唯一可以催化水解c AMP和c GMP的关键酶,其中PDE4特异性水解c AMP,PDE5特异性水解c GMP。设计合成新型PDE4/5双靶点抑制剂可调控多种相互关联的病理途径,为机制复杂的神经退行性疾病提供个性化治疗方案。因此,本论文的研究内容和具体结果如下: 1、PDE4和PDE5抑制剂联合用药协同抗神经炎症。转录组测序(Transcriptome Sequencing,RNA-seq)分析显示Rolipram(PDE4特异性抑制剂)和Tadalafil(PDE5特异性抑制剂)联合用药调节与c AMP、c GMP以及炎症信号通路相关基因表达。酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)实验对上述结果进行验证,结果表明,Rolipram和Tadalafil的联合用药增加经脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)激活后的BV2细胞中c AMP、c GMP含量、降低白介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNFα)水平。Chou-Talalay分析结果显示Rolipram和Tadalafil联合用药抑制IL-1β、IL-6和TNFα生成的联用指数(combination index,CI)均小于0.8,说明同时抑制PDE4/5可协同调控炎症反应。水迷宫(Morris water maze,MWM)实验证实Rolipram和Tadalafil联合用药可改善前体蛋白/早老性痴呆基因(amyloid precursor protein/presenilin-1,APP/PS1)小鼠的学习和记忆。ELISA和蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)实验结果显示Rolipram和Tadalafil联合用药增加APP/PS1鼠皮层和海马区c AMP、c GMP含量、降低IL-1β、IL-6和TNFα水平以及促进c AMP反应元件结合蛋白(c AMP-response element binding protein,CREB)磷酸化、上调脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达,说明联合用药显著抑制了APP/PS1小鼠大脑中的炎症反应并具有神经保护作用的潜力。据此提出PDE4/5双靶点抑制剂是一种良好的神经炎症治疗药物作为本论文研究假说。 2、新型PDE4/5双靶点抑制剂的设计与合成。通过分析PDE4和PDE5蛋白结构特点并利用骨架跃迁策略,确定苯并咪唑结构为新设计合成的PDE4/5双靶点抑制剂的母核。在支链的改造上选择刚性从强到弱的乙酰胺、甲基到最终的乙基连接链。PDE4/5活性抑制实验结果表明乙基连接链的灵活性提高了化合物对PDE4/5的抑制活性,并结合成药性预测,最终选择此系列中对PDE4/5有着均衡且强抑制活性的B-2-3、C-2-4、C-3-1和F-3-1用于进一步的活性筛选。 3、新型PDE4/5双靶点抑制剂抗神经炎症作用研究。细胞计数(Cell Counting Kit-8,CCK-8)实验结果显示,在10μM和20μM浓度下,C-3-1可显著提高经LPS刺激后的BV2细胞活力。并且C-3-1具有长期给药安全、可透过血脑屏障等特点。MWM实验结果显示C-3-1可显著逆转APP/PS1小鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数以及目标象限停留时间,表明C-3-1可改善APP/PS1小鼠学习和认知能力。ELISA、WB、免疫荧光(immunofluorescence,IF)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)、脑内神经元苏木精-伊红(Hematoxylineosin staining,HE)染色等实验结果显示C-3-1可增加LPS诱导后的BV2细胞和APP/PS1小鼠脑内c AMP、c GMP含量并显著上调p-CREB和BDNF表达,说明C-3-1通过增加c AMP和c GMP含量,激活下游CREB信号级联通路;C-3-1使得促炎因子IL-1β、IL-6和TNFα水平显著降低,说明C-3-1显著抑制BV2细胞和APP/PS1小鼠脑内的神经炎症反应;C-3-1可显著抑制APP/PS1小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞活化;C-3-1可将高度有序的Aβ斑块解聚为无稳定结构且可被正常代谢的聚集体;C-3-1还可增加尼氏小体和神经元数量以及抑制神经元凋亡,表明C-3-1具有神经保护作用。 4、新型PDE4/5双靶点抑制剂抗神经炎症机制研究。RNA-seq分析结果显示C-3-1调节核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun Nterminal kinase,JNK)信号通路相关基因表达。采用WB对上述结果进行验证,结果显示,C-3-1可抑制LPS诱导后的BV2细胞和HT22细胞中PDE4和PDE5表达,并导致NF-κB抑制剂α(inhibitor of NF-κB,IκBα)/NF-κB信号通路失活,以及通过抑制c-Jun和JNK的磷酸化,进而阻断c-Jun/JNK信号通路。以上结果表明C-3-1是通过靶向NF-κB/JNK信号通路抑制神经炎症,从而发挥神经保护作用。综上所述,本论文证明同时抑制PDE4/5可减轻神经炎症,并以阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)作为疾病模型评估抑制PDE4/5减轻神经炎症后的治疗作用。结果显示在调节神经炎症过程中,与单独抑制PDE4或PDE5相比,同时抑制PDE4/5具有协同作用,因此靶向PDE4/5设计先导化合物具有科学价值。据此,本课题设计合成新型PDE4/5双靶点抑制剂,评估其调控神经炎症的有效性及安全性,并使用RNA-seq技术探索新型PDE4/5双靶点抑制剂作用机制网络,为其作为先导化合物开发AD创新治疗药物提供数据支撑。

摘要译文

关键词：

神经炎症; PDE4/5双靶点抑制剂; NF-κB; JNK

学位年度：

2024

学位类型：

博士

学科专业：

生物医学工程

导师：

师健友

中图分类号：

R965[实验药理学]

学科分类号：

100109[医学药理学];100603[中西医结合药学];100706[药理学]

D O I：

10.27005/d.cnki.gdzku.2024.000054